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猪病实验室快速诊断技术 四川省川龙动科药业有限公司 猪病越来越多、越来越复杂 如何诊断？ 病理剖检变化、流行病学资料、 实验室诊断、生产记录等判定疑似疾病 细菌的染色 ↓ 形态学观察 ↓ 培养基的制备 ↓ 细菌分离培养 ↓ 移植 ↓ 细菌的生化试验 ↓ 药物敏感试验 病猪的现场剖检 病猪病料的采集、保存 总RNA的提取 ↓ 反转录 ↓ 聚合酶链式反应（PCR） 猪瘟病毒抗体 猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒) 猪流感血凝抑制试验 猪细小病毒病乳胶凝集试验（LAT） 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 ↓ DNA提取 ↓ PCR 血清学检测 分子诊断 细菌分离 ↓ 结果分析 一、细菌学检查及药敏试验 病料采集、包存、运输 细菌的分离培养 细菌的染色 显微镜下细菌的形态学观察 药物敏感试验 指导临床用药 病料的采集、保存和运输 无菌取样 供细菌学检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理。 典型采样　选取症状最典型或病变最明显的样品。? 低温保存运输。 细菌分离培养 普通琼脂 血液琼脂 EMB培养基 大肠杆菌、沙门氏菌 麦康凯培养基 大肠杆菌、沙门氏菌 SS培养基…… 沙门和志贺菌筛选 溶血反应，如链球菌 EMB培养基－－大肠杆菌呈紫黑色金属光泽的菌落 细菌的染色 革兰氏染色法：G＋细菌、G－细菌 芽孢染色法：梭菌、芽孢杆菌 抗酸染色法 鞭毛染色法 荚膜染色法 显微镜下细菌形态学观察 杆菌 球菌 梭菌 芽孢 放线菌 鞭毛、菌毛 革兰氏染色法－ G＋细菌 革兰氏染色法－ G－细菌 传统细菌学检查耗时周期长、操作步骤多细菌病的快速诊断－－快速药敏试验 快速筛选治疗细菌感染的敏感药物 无菌操作取一小块病料组织，涂布于普通 琼脂平板和血平板上，加药敏纸片培养14-18 小时，或采用钢管法加入待筛选药液。 结果判断 抑菌圈直径大于14mm表示极敏感 抑菌圈直径12－14mm表示敏感 抑菌圈直径10－12mm表示中度敏感 抑菌圈直径小于8mm表示不敏感。 选择敏感度高的即抑菌圈大的药物进行临床治疗 二、PCR和血清学诊断 病毒性疾病 传统实验室诊断方法 PCR结合琼脂电泳、ELASA（酶联免疫吸附法）、红细胞凝集抑制试验、LAT(乳胶凝集试验)、 免疫组化等。 传统PCR需要提取纯化DNA、RNA，耗时耗资，手动操作步骤多，易受干扰。 直接PCR技术 病毒性疾病的快速诊断－2小时出结果 直接PCR方法使PCR可以直接从样本开始，为DNA扩增带来前所未有的便捷。未经DNA纯化而直接使用微量原始样本做模板，为PCR实验节约大量的时间和成本。 采集血液样品或组织样品 组织样经裂解液预处理（血清不处理），与特定的引物及反应体系（DNA聚合酶、碱基、荧光染料等）混合均匀，直接放入荧光定量PCR仪中进行扩增。 优势 无需进行昂贵又费时的DNA抽提 样品需求量小 实验方案简便，手动操作步骤少 实验时间极短 可大批量检测样品