PCR讲课.pptVIP

不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 几种重要的PCR衍生技术 目的基因的克隆 基因的体外突变 DNA和RNA的微量分析 DNA序列测定 基因突变分析 遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域 PCR的主要用途 PCR技术在军团菌检测中的应用 16srRNA LEG 225 5’-AAGATTAGCCTGCGTCCGA-3’ LEG 858 5’-GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’ DnaJ W19F 5’-AGGTGGTTTTGGCGGATTTGG-3’ W19R 5’-TGAATTCTGACTTGCCCCATG-3 ’ PCR常见问题及对策 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 PCR常见问题之一 无扩增产物 模板 Buffer 引物 反应条件 原 因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 阳性对照有条带，而样品则无 PCR常见问题之二 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 非特异性扩增 PCR常见问题之二 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 非特异性扩增 PCR常见问题之三 拖尾 现象：产物在凝胶上呈弥散状态。 M 1 2 PCR常见问题之三 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 PCR常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 PCR常见问题之五 1 模板间交叉污染 2 PCR试剂污染 3 实验室中克隆质粒的污染 防止污染的方法 1 合理分隔实验室 2 移液枪不能接触PCR相关试剂 3 手套、吸头、小离心管应一次性使用 4 设阳性和阴性对照，重复实验 对PCR方法的错误概念 1.不能替代传统的血清学分型、分群方法 2.PCR方法不是万能的 3.PCR方法不是诊断手段，而是一种实验室的研究方法需要与其他方法配合使用。 * * DNA nucleotides, the building blocks for the new DNA Template DNA, the DNA sequence that you want to amplify Primers, single-stranded DNAs between 18 and 30 nucleotides long (oligonucleotides) that are complementary to a short region on either side of the templat