周工作总结-0711.doc

周工作计划： 96孔板，用CVF激活补体，取不同时间点的样，检测细胞上清中TM、TF、PAI-1、t-PA的变化。 24孔板，用Hcy刺激内皮细胞，取不同浓度Hcy、不同时间点的样，检测细胞上清中IL-6、IL-8的变化。 预订磷酸化IkB-α抗体，练习WB。 开展高剂量绿原酸、咖啡酸、阿魏酸对内皮细胞的影响实验。 调整孵育时间，继续用不同浓度Hcy（终浓度为3、1、0.5mM）激活血清中的补体，用绵羊血红细胞检测所孵育样品的活性。 96孔板，用CVF激活补体，取不同时间点的样，检测细胞上清中TM、TF、PAI-1、t-PA的变化。 24孔板，用Hcy刺激内皮细胞，取不同浓度Hcy、不同时间点的样，检测细胞上清中IL-6、IL-8的变化。 开展高剂量绿原酸、咖啡酸、阿魏酸对内皮细胞的影响实验。 调整孵育时间，继续用不同浓度Hcy（终浓度为3、1、0.5mM）激活血清中的补体，用绵羊血红细胞检测所孵育样品的活性。 CVF激活补体试剂盒相关指标的测定： 1、将单层融合HMEC（含20%胎牛血清的1640培养）弃去培养基，加入2ml胰酶在37℃中消化2-3分钟后加入培养液终止消化，将细胞悬液移至离心管中960r/min离心10分钟，弃去上清液加入1ml含有20%胎牛血清的1640培养基，混匀后取10μl计数，根据计数将细胞悬液稀释，然后将HMEC以浓度为1×105个/ml接种96孔板，每孔500μl于37℃、5% CO2培养箱中培养24h，弃去培养基，用无血清的1640（100μl）洗一次细胞，大约30s后弃去无血清1640，再加入140μl无血清1640，然后加入孵育好的孵育产物60μl，按时间点要求取样。 2、孵育样品： CVF组（NHS:PBS:CVF=3:2:1） INHS组（INHS:PBS:CVF=3:2:1） CVF组和INHS组于37℃恒温水浴锅孵育30min。 NHS在56℃水浴锅中30min即为INHS；将CVF（1mg/ml）以PBS稀释10倍至100μg/ml。 3、加样：按以下体系加样 CVF组 60μl孵育产物（CVF+NHS）+ 140μl无血清1640 INHS组 60μl 孵育产物（CVF+INHS）+140μl无血清1640 4、取样：根据不同试剂盒，按所需的时间点取样。 t-PA检测 按上述所述的步骤加孵育产物（血清批次150），按0h，6h，12h，24h时间点取样，每孔取样约200μl，混匀，取样后冻存于﹣20℃备用。分别测150、150批次0h，6h，12h，24h的样品，化冻后2000r/min离心10min取上清，样品不稀释，按试剂盒说明书进行检测。检测时温度25℃，湿度60%。检测结果存于酶标仪电脑：F\softmax\ZY\t-PA\15070。 时间（h） 0 6 12 24 CVF组 0707 0.638 0.994 1.499 1.705 0708 0.726 0.819 1.446 1.904 以150702标准曲线计算各组浓度（ng·ml-1），结果如下： 时间（h） 0 6 12 24 CVF组 0707 0.15 0.30 0.63 0.83 0708 0.18 0.22 0.58 1.08 t-PA检测的标准曲线150702结果如下（检测温度25℃）： 浓度/ng·ml-1 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.0313 0 OD 2.3 1.881 1.31 0.913 0.531 0.385 0.309 0.098 PAI-1检测 按上述所述的步骤加孵育产物（血清批次150），按0h，6h，12h，24h时间点取样，每孔取样约200μl，混匀，取样后冻存于﹣20℃备用。分别测150618、150629批次0h，6h，12h，24h的样品，化冻后2000r/min离心10min取上清，样品稀释，按试剂盒说明书进行检测。检测时温度25℃，湿度60%。检测结果存于酶标仪电脑：F\softmax\ZY\ PAI-1试剂盒\15070。 时间（h） 0 6 12 24 备注 CVF组 0708 1.932 2.068 2.56 2.463 原液测定 0709 0.75 1.402 1.675 1.835 稀释5倍 0710 0.717 1.386 1.663 2.089 稀释5倍 以150702标准曲线计算各组浓度（ng·ml-1），结果如下：时间（h） 0 6 12 24 备注 CVF组 0708 2.72 3.26 8.61 6.59 原液测定 0709 3.22 7.33 9.98 12.05 稀释5倍 0710 3.06 7.19 9.84 16.80 稀释5倍