实时PCR技术检测肠弯曲菌的开发与应用.docVIP

实时PCR技术检测空肠弯曲菌的开发与应用 摘要 目的：建立实时聚合酶链反应（PCR）方法来检测和量化粪便中的空肠弯曲杆菌。 方法：将引物和探针的实时PCR检测基于空肠弯曲杆菌的HIPO基因的特定的DNA序列上。探针与硝化细菌属和其他肠道病原体的特异性想拮抗。对最优的PCR反应条件进行了测试，一组确定用一个标准的空肠弯曲杆菌作为模板条件。该检出限是从所得细菌培养中使用纯化的DNA，并从粪便中提取DNA标本。242个标本用于用实时PCR技术检测空肠弯曲菌的分析。 结果：最佳的PCR反应体系确定使用参照DNA模板，1×尿嘧啶DNA糖基化酶，3.5 mmol / L的氯化镁 ，1.25ü铂的Taq聚合酶，0.4 mmol / L的PCR扩增核苷酸混合物，0.48μmol/ L的每种引物，0.2μmol/ L的探针和2微升DNA的模板，最终体积为25微升。 PCR反应进行如下：95℃4 min，然后10秒95℃，30秒59℃循环45个。检测极限为从细菌培养中纯化的DNA为4.3 CFU / mL，从粪便标本中提取的DNA为1000CFU / g。从细菌培养分离出二十（8.3％，242分之20）空肠弯曲菌菌株，而用实时PCR发现41（16.9％， 二百四十二分之四十一）个样本。 PCR产物的DNA测序表明空肠弯曲杆菌在样品中的存在。一个空肠弯曲菌和沙门氏菌混合感染的检测在一个标本和PCR测试对于这个标本是积极的。 结论：从粪便标本中检测空肠弯曲菌用PCR法比用直接培养法的敏感性要高。 关键词：空肠弯曲菌;实时聚合酶链式反应;应用 引言 全世界人类细菌性胃肠炎主要原因是弯曲杆菌，沙门氏菌属，耶尔森菌属，志贺氏菌，大肠杆菌(大肠埃希氏菌O157)。弯曲杆菌、空肠弯曲菌（空肠弯曲杆菌）是影响人类弯曲杆菌的主要物种。因为对弯曲杆菌感染进行了调查，随后在中国20世纪80年代初有相当大的研究兴趣，已经有不少在腹泻患者中检测室空肠弯曲杆菌感染的报告。然而，20世纪90年代空肠弯曲菌腹泻患者放入报告后期以来已减少。改善卫生条件可以解释这种数量的下降，然而，在检测到这种病原菌难度可能是另一个报告和隔离的频率数量减少。我们最近的试验研究表明，这种病原体的分离，腹泻患者粪便标本的比例为监测点在不同实验室之间的显着不同（2％-15％未发表）。灵敏，准确的检测这种病菌是很重要的，无论是对患者的治疗和流行病学研究分析，随着基因组DNA测序，在线数据库和生物信息学分析，核酸方法，特别是聚合酶链式反应的发展（PCR）的方法，已成为有前途的工具，用于快速，可靠，灵敏地检测和诊断病原感染。在这项研究中，我们开发了一个实时PCR法检测空肠弯曲杆菌，然后，我们比较从腹泻患者获得粪便标本用PCR分析DNA序列和直接培养法检测空肠弯曲菌。在这项研究中获得的结果证明患者腹泻用于PCR检测空肠弯曲杆菌感染，可能会导致空肠弯曲菌的分离预筛选方法的发展。 材料与方法 样品采集和基于细菌培养技术的检测 242个粪便从十一家医院腹泻患者ED（年龄介于6至72岁）收集。该标本转移至实验室细菌培养4小时。该样品的其余部分在-80 ℃冻结，进行DNA提取。无菌棉签在每次大便样本中挑染，选择性Skirrow琼脂平板组成的哥伦比亚琼脂基础（ CM331,Oxoid公司，英国Basingstoke）,选择性补充（ SR0069 ，Oxoid公司）,和5％去纤维羊血。将板温育在微需氧环境中（5％氧气，10％ 二氧化碳和85％ 氮气） ，在42 ℃ 培养48小时。挑取可疑菌落，并通过革兰氏染色鉴定，根据我们以前的报告，用氧化酶和过氧化氢酶试验和马尿酸盐水解分析。所有标本均同时检查是否存在志贺菌属，沙门氏杆菌，耶尔森菌属和大肠杆菌O157，分别通过细菌上的木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂，脱氧硫化氢乳糖琼脂，头孢磺啶- 氯苯酚 - 新生霉素琼脂和山梨醇麦康凯琼脂。可疑菌落用API 20E条进行生化鉴定，并将培养物通过进一步的血清型或PCR分析证实。 细菌培养DNA的制备 参照基因组DNA从在这项研究中的空肠弯曲分离物通过使用QIAamp DNA迷你试剂（Qiagen，杜塞尔多夫，德国）培养提取。脱氧核糖核酸从其他病原体的参考模板，李怀奇京和彪侃参考的DNA模板如表1所示。 引物和探针设计 该hipO基因的特定DNA片段使用BLASTN和Vector NTI 6.0软件进行了比较。由上海辉瑞生物技术有限公司设计并合成引物和探针组。在这项研究中使用的引物和探针的序列分别为： hipO-F,5’-CGGATAGTTATAGTATTGAAGT-TATTGG-3’, hipO-R,5’-GAAGCAGCATAAATAG-GATCTTTTG-3’, hipO-P,5’-FAM-TTCTGGAG-CACTTCCATGAC