荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B的含量.docVIP

荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量 一、实验目的 1、学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理； 2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。二、实验原理： 在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 2、荧光光谱 激发光谱：固定测量波长 选最大发射波长 ，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。 发射光谱：固定激发光波长 选最大激发波长 , 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 3、荧光分析仪器 4、维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其式为： 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。 维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH 6～7的溶液中荧光强度最大，在pH 11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。 多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。三、试剂与仪器: 970CRT荧光光度计5 ml吸量管1只，2 ml吸量管1只，50 ml容量瓶只 10.0μg/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸， 多维葡萄糖粉试样四、实验步骤: 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： ?在个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.0.5，0.6/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。未知试样的测定称取g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入0 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次五、数据处理：1. 最大发射波长的选择 2.最大激发波长的选择 3. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 浓度 μg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 荧光强度I 209.3 378.5 554.9 739.8 911.5 1074 4.未知样品浓度的测定 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。 1 2 3 平均值 I 312.1 311.9 311.7 311.9 C/ug.ml-1 0.1594 0.1592 0.1591 0.1593 维生素B2百分含 0.1593×50×10-6 /0.1331×100％ 0.0060％ 六、、思考题：1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。 标准曲线为 y 1745x + 33.927 由曲线可知，最大激发波长为 445nm 由曲线可知，最大发射波长为526nm 液槽 显示器 单色器 检测器 I0 I If 光源 单色器