沉淀法.pptVIP

通过本章学习应掌握以下内容 什么是沉淀法？ 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 等电点沉析的工作原理是什么？ 概述 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：分离度不高、选择性不强 沉淀法的目的： 浓缩 有选择地沉淀 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 基本原理: 采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的 沉淀生成动力学 ①热运动 ②对流运动，由机械搅拌产生 ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 沉淀法的分类 蛋白质的溶解特性 蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子 常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 （767g/L） 盐析操作(加盐方式） ②加(NH4)2SO4饱和溶液： 实验室和小规模生产，可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 V=V0(S2-S1)/(1-S2) V: (NH4)2SO4饱和溶液的体积 V0：溶液的原始体积，L Cohn方程式 β和Ks的物理意义 β—代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率； 与温度和pH无关，和蛋白质与盐的种类有关。 Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析 一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。 β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析 盐析用盐量的确定-饱和度： 饱和度（Saturation）： 以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度 为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。 4)pH值和温度的影响 5）蛋白质浓度 浓度↑，所需盐浓度↓ 2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中 (25 mg/mL～30mg/mL) 等电点沉淀实例 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原： 胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。 工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取： 发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂沉析剂 选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中 容易获取 乙醇、甲醇、丙酮 影响因素 1、温度 有机溶剂预冷：-10至-20℃ 缓慢加入，低温操作 2、pH值：待沉蛋白质pI附近 避免目标蛋白与杂质带相反电荷 3、样品浓度： 蛋白质：0.5～2％，多糖：1～2％ 　 4、中性盐浓度：0.01～0.05mol/L 常用：醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等 5、某些金属离子： 如Ca2+、Zn2+等有利于沉淀形成， 并降低溶剂用量。 四、非离子型聚合物 五、聚电解质沉淀 机理 Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。 Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。 MgSO4用以去除DNA和其他核酸 七、选择性变性沉淀法 八、亲和沉淀 硫酸铵溶解尿激酶锌络合物 各种沉淀方法应用范围 盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。 非离子聚合物沉淀法：用于分离生物大分子。 金属离子沉淀：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 选择性沉淀：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。 沉淀法应用 利用蛋白质沉淀大规模提纯血浆蛋白：Co