实验二_血涂片及染色.ppt

血涂片制备和染色 【目的】掌握血涂片的制备和染色。 【原理】把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，用瑞氏染液染色。不同的细胞种类及细胞的不同成分，对酸性及碱性染料的结合能力不同，而使各种细胞呈现出各自的染色特点。 【器材】载玻片、推片、洗耳球、显微镜、香柏油、拭镜纸、清洁液。 【标本】EDTA，静脉血。 瑞氏染色法 【试剂】 1．瑞氏(Wright)染液 (1)I液:包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇600ml、甘油15ml。 (2)Ⅱ液:磷酸盐缓冲液(pH6.4～6.8)，含磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠0.2g、蒸馏水加至 1 000ml。 【操作】 (1)采血 (2)推片，推片与载片夹角30~45°平稳地向前移动，血膜应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。 (3)干燥: 晃动。37℃温箱中促干。 (4)染色: 将玻片平置于染色架上，滴加 (Ⅰ液)3～5滴，约0.5～lmin后，滴加等量缓冲液(Ⅱ液)，摇动玻片混匀。 (5)冲洗: 5-10min后用流水冲去染液，待干。 (6)观察结果: 将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。 血涂片分布不均主要原因： 推片边缘不齐、用力不均匀、载片不清洁 THANKS * * 一张良好血涂片的要求： 厚薄适宜 头体尾明显 细胞分布均匀 边缘整齐 两端和两边留有空隙 标准血涂片 四、瑞氏染色法 (Wright’s stain) 1. 瑞士染液成分： ① 美蓝（亚甲蓝）：M＋碱性染料，易氧化称为天青。 ② 伊红：E－酸性染料 ③ 瑞氏染料：M＋＋E- 　 ME↓（伊－美中性物） ④甲醇： 溶解染料；固定细胞形态；蛋白质呈颗粒或网状，增加细胞与染料的接触。 H2O 甲醇 四、瑞氏染色法 (Wright’s stain) 1. 染液成分： ① 美蓝（亚甲蓝）：M＋碱性染料 ② 伊红（曙红）：E－酸性染料 ③ 瑞氏染料：M＋＋E- 　 ME↓（伊－美中性物） ④甲醇： 溶解染料；固定细胞形态；蛋白质呈颗粒或网状，增加细胞与染料的接触。 H2O 甲醇 pH 的影响： H＋：碱性染料亲和力下降，增强伊红着色，出现红染 OH－：酸性染料亲和力下降，增强美蓝着色，出现 蓝染 PBS缓冲液：pH 6.4－6.8 以维持恒定的pH环境 3. 染色方法 ① 固定： 滴加染液3 ~ 5滴，固定细胞 0.5 ~ 1 min ? ② 染色： 加1 ~ 2倍 PBS 缓冲液，混匀染5 ~ 10min ? ③ 冲洗： 用流水冲去染液或加PBS 缓冲液冲洗，待干。 4. 染色结果 ① 外观：淡紫红色 ② 镜下： 红细胞――粉红色 白细胞――胞核、胞浆及颗粒显示特有的染色特征 5. 注意事项 ① 血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落； ② 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好； ③ 染液不能过少，以防蒸发沉淀； ④ 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料 沉着。冲洗时间也不能长； ⑤ 染色过淡时可复染，复染时先将染料稀释好； ⑥ 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色； ⑦ 分类最佳区域为体、尾交界处。 *