共聚焦显微镜原理.docx

激光共聚焦显微镜的构件与原理一、主要构件：一个完整的激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。硬件包括表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备，软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成。1、Illuminating pinhole:照明针孔 功能:使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。 2、Objective:物镜 3、Focal plane:焦平面 功能:激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过objective、beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及 detector pinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。 4、Detector pinhole:探测器针孔功能:与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。 5、PMT：光电倍增管（探测器） 功能:接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。 6、激光器 我们可以根据研究需要选择不同的激光器。ArUV(351、364 nm)， AR(457、488、514 nm)，HeNe(543 、633 nm)等 二、基本原理：传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰。激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源，点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。Figure 1.The principal light pathways in a basic confocal microscope configuration.双光子显微镜一、基本原理：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2 个长波长（能量小）的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量。Figure 2. Principles of Two-Photon Excitation二、特点：1、物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，从而大大提高成像亮度和信噪比；2、长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；3、焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面（焦平面的荧光分子不被双光子激发），使激发光以穿透更深的标本，轴向分辨率更高；4、长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；5、使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。总之，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。