肝糖原考试课件2.docVIP

实验试卷例 姓名 ，第 班， 月 日，星期 一、实验题目 肝糖原的提取、鉴定与定量 二、目的要求 1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 （一）肝糖原的提取、鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4十2NaOH ═ Na2 SO4+Cu OH 2↓ 2Cu OH 2十C6H12O6 ═ 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH ═ Cu2O↓ 红色 +H2O Cu OH 2 ═ CuO↓ 黑色 +H2O （二）肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在 10 100 g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。 三、实验材料 （一）仪器 1. 普通离心机，室温 100℃恒温水浴箱（×2），722型分光光度计，精度为10mg级电子天平（×1） 2. 剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1） 3. 试管架（×1），10mL离心管（×2），（100×15）mm试管（×6） 4. 刻度吸量管（2mL×1，5 mL×2），1000μL微量可调取液器（×1） 5. 100mL容量瓶（×1） 6. 白瓷反应板（×1） （二）试剂 1. 鸡肝。 2. 95％乙醇。 3. 0.31mol/L 5％ 三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2，163.39）5g，加蒸馏水溶解至100 mL。 4. 0.15mol/L NaCl溶液：称取8.8g NaCl加蒸馏水溶解至1000 mL。 5. 12mol/L HCl：浓HCl原液（36% 38%）。 6. 12.5mol/L 50％ NaOH：称取NaOH 50g，用蒸馏水溶解至100mL。 7. 碘试剂：碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中。 8. 班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7·5H2O，294.10）17.3g和无水碳酸钠（Na2C03，105.99）100g溶于蒸馏水700mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3％硫酸铜（CuSO4·5H2O，249.68） l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。 9. 5.35mol/L 30％ KOH溶液：称取KOH 30g，加蒸馏水溶解至100 mL。 11. 标准葡萄糖液 50mg/L ：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，加蒸馏水溶解至500 mL。 12. 17mol/L 90％ H2SO4：量取蒸馏水30mL，加浓H2SO4500 mL。 13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4 5天。 四、操作步骤 吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。 （一）肝糖原的提取与鉴定 操作流程如下。 鸡肝约1.5 g，剪碎 ＋5%CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 ＋5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min） 沉淀（弃去） 上清（取3 ml） ＋3 ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟 离心5分钟（4000 r / min） 上清（弃去） 沉淀 ＋蒸镏水2 ml 沸水浴2分钟，溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml ＋浓HCl 5滴 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却 糖原溶液2滴 加蒸馏水2滴 ＋50%NaOH 5滴 呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液 ＋班氏试剂2