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分光光度法 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 内容 分光光度法 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。 分光光度法分类 紫外分光光度法（200～400nm） 可见分光光度法（400～760nm） 红外分光光度法（760～10000nm） 分光光度法的原理-1 Lambert-Beer定律 分光光度法的原理-2 分光光度法的原理-3 分光光度法的原理-4 分光光度法的原理-5 如何求被测组分的含量 1.利用标准管计算测定物的含量 2.利用标准曲线计算测定物含量 3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度 利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定同种已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU）， 利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 分光光度计的基本结构 V-1100型可见光分光光度计 V-1100分光光度计 使用注意事项 注意防震、防潮、防光和防腐蚀。 每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。 不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。 盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防溶液溢出。 比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。 注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。 测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。 操作练习实验材料 试剂： CuSO4标准液 （8mg/ml） 待测CuSO4溶液 蒸馏水 器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架 V-1100型可见光分光光度计 操作练习步骤 数据处理表格 结果计算 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 生物化学与分子生物学实验教学中心 3 分光光度法的原理 1 如何求被测组分的含量 2 分光光度计的基本结构 分光光度计的使用与注意事项 4 3 即：I0=IA+IR+IT（所用比色皿同质料同规格，反射光强度为一定值） 故：I0 =IA+ IT I0 IT 入射光强度 透过光强度 L C 液层厚度 溶液浓度 IA 反射光强度IR 吸收光强度 由式中可知：当入射光强度I0为一定时，被吸收光强度IA愈大，则透过光强度IT愈小。即透过光强度减弱仅与有色溶液对光线的吸收有关。 实验证明：溶液质量浓度C愈大，深层厚度L愈厚，则溶液对光线吸收得愈多。 它们之间的关系是： 标准曲线(浓度-吸光度曲线） 0.2 0.8 0.4 0.6 A 0 1 2 3 4 5 × × × × 根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 C 光源 单色 光器 吸收池 检测器 显示 钨丝灯可见光源350~1000nm 氢灯 氘灯 紫外光源 200~360nm 棱镜 衍射光栅 玻璃比色杯 石英比色杯 硒光电池 光电管 光电倍增管 玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区。 石英——不吸收紫外光，适于紫外和可见光区。 将光信号转变为电信号的装置。 记录装置：讯号处理和显示系统。 0.000 A T C F MODE PRINT 0%T 100%T A：吸光度 T：透射比 C：浓 度 F：斜 率 MODE ATCF切换键 PRINT 确认键 0%T 100%T 校零、下降键 校100、上升键 V-1100分光光度计键盘控制的使用说明 V-1100分光光度计操作步骤 开机，预热30分钟。 转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到T档。 将黑体放入光路中，合上盖，按 键校零,T=000.0。 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校T=100.0 合上盖，按 键切换到A档 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可