实验七酵母菌的形态观察及微生物的显微直接计数法资料.pptVIP

实验六 酵母菌的形态观察及微生物的显微直接计数法 一、实验目的 1??学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。 ? 2 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下微生物直接计数的方法。 二、实验原理 1 酵母菌形态观察及死活细胞的鉴别 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片或水—碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。 2 血球计数板的计数原理 三、实验材料与器材 菌种：酿酒酵母 培养基和试剂：麦芽汁琼脂培养基，0.05％ 和0.1 吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液. 显微镜，玻片血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、 吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四 操作步骤 （一）酵母菌形态观察 1、菌种活化 将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，25~28℃培养48 h左右备用。 2、美蓝镜片的观察 1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。 2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。 5）用0.5%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 3、水一碘液镜片的观察 在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。 注意事项 1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。 2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。 （二）微生物显微镜直接计数?? 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2，每个小方格5－10个菌体为宜），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管或毛细吸管吸取少许，由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，使计数室充满菌液。 4 静置5分钟，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。 5．计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于格线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。(调节光亮度和聚光器使计数区的格线清晰) 6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml菌悬液所含酵母菌细胞数量。 7清洗计数板 思考题 1. 根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液及作用时间与酿酒酵母死、活细胞比例变化是否有关系？试分析原因？ 2. 酿酒酵母除了通过出芽方式无性繁殖外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？若未观察到，试分析原因。