蛋白质一级结构(共价结构).docVIP

蛋白质的一级结构（共价结构） 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。 蛋白质结构层次 一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构） ↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 ↓ 超二级结构 ↓ 构象（高级结构） 结构域 ↓ 三级结构(球状结构) ↓ 四级结构(多亚基聚集体) 一级结构的要点 ． 蛋白质测序的一般步骤 祥见 P116 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 拆分蛋白质分子中的多肽链。 测定多肽链的氨基酸组成。 断裂链内二硫键。 分析多肽链的N末端和C末端。 多肽链部分裂解成肽段。 测定各个肽段的氨基酸顺序 确定肽段在多肽链中的顺序。 确定多肽链中二硫键的位置。 蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 核酸测序，一次可测600-800bp 测序前的准备工作 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠） ⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 ⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸 测定分子量 用于估算氨基酸残基n= 方法：凝胶过滤法、沉降系数法 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式： ⑴非共价键结合 8mol/L尿素，SDS SDS测分子量 ⑵二硫键结合 过甲酸氧化： —S—S—+HCOOOH → SO3H β巯基乙醇还原： 举例:： 血红蛋白 (α2β2) （注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。） 分子量： M 拆亚基： M1 、M2 两条带 拆二硫键： M1 、M2 两条带 分子量关系： M = 2M1 + 2M2 测定氨基酸组成 主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。 确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 ①Trp测定 对二甲基氨基苯甲醛 590nm。 ②Cys 测定 5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm 端基分析 ①N端分析 DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。 DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等 PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。 ②C端分析 A．肼解法 H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH 氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。 B．羧肽酶法（Pro不能测） 羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B：只水解Arg、Lys N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C 图 P118 羧肽酶法测C末端 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 化学裂解法 ①溴化氰 —Met—X— 产率85% ②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率70-100%