dean20100925085331.pptVIP

蛋白质的分离纯化 主要参考书 4 电泳：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电 聚焦电泳，双向电泳。 5 蛋白质鉴定 （1）蛋白质纯度鉴定 （2）蛋白质浓度测定 （3）蛋白质活性测定 蛋白质的结构研究  一级结构： （1）氨基酸组成分析 （2）末端分析 （3）肽谱分析 二级结构： （1）紫外光谱法 （2）荧光光谱法 （3）红外光谱法 （4）圆二色性法 CD谱 （5）激光拉曼光谱法 高级结构：（1）X－射线衍射法 （2）核磁共振法 NMR 蛋白质结构与功能的关系 1.突变 2.晶体分析 3.蛋白与蛋白的相互作用 一. 材料获得 1 原核细胞表达 大肠杆菌 表达载体：目前较常用的是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25％以上。T7－RNA聚合酶的活性高于大肠杆菌RNA聚合酶，它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增。 宿主菌：细菌染色体上含有噬菌体T7－RNA聚合酶基因，它的启动子为Lac启动子，可被IPTG诱导。 融合蛋白：常用6－10组氨酸－融合蛋白，只增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较小。GST－融合蛋白，选择大肠杆菌偏爱的密码子，容易表达外源蛋白。融合蛋白往往有利于表达和纯化。 用途：制备抗体，生化性质研究，结构研究。 优点：操作简单，产量高，成本低。 缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 培养条件：根据不同研究目的，选择培养条件。 如制备抗体只需得到包涵体，因为包涵体容易纯化而且制备抗体不需活性蛋白。包涵体是细菌大量表达外源蛋白时，由于蛋白形成过多过快而不能正常折叠而形成的不溶性颗粒。 生化性质研究和结晶需要有活性的可溶性蛋白，需要选择培养条件如低温，降低表达速度，添加辅助因子，改变宿主菌等。 2 真核细胞表达 （1）酵母 表达载体：诱导型载体如pBM150 GAL1启动子 ，pAM82 PHO5启动子 ； 组成型载体pAAh5 ADH1启动子 。 宿主细胞：营养缺陷型菌株如URA3－，LEU2－，HIS3－，TRP1－等。 （2）动物细胞 表达载体：SV40复制起点, （CMV或SV40）病毒启动 宿主细胞：人Hela细胞，猴COS细胞，小鼠3T3细胞等 （3）植物细胞 表达载体：CaMV-35S启动子，Ti质粒左右 边界 宿主细胞：烟草TBY2细胞 优点：表达产物经过正确修饰，一般具有 天然活性。 缺点：操作比较复杂，表达量较低，成本 较高。 （一）破细胞 动物，植物细胞：匀浆，研磨 大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶 （二）抽提 1.pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸 盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待 分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓冲液 浓度为20－50mM。 2.温度： 低温如4－10℃，蛋白酶活性较低。 3.离子强度：如0.1－0.2 M NaCl或KCl. 4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保 护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂 EDTA，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF。 三、细分离 层析一般步骤： 处理介质 ↓ 装柱 ↓ 平衡 ↓ 上样 ↓ 洗涤 ↓ 洗脱 ↓ 介质再生 举例1：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶 溶菌酶：分子量为14KD， 等电点为11， 耐热，能够水解革兰氏阳性细菌 的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。 举例2：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3 举例：利用Phenyl-Sepharose F.F.纯化牛脑钙调素 取新鲜或冷冻牛脑100mg，加入100毫升预冷的抽提液（50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 1mM EDTA,1mM DTT, 1mM PMSF, pH 7.5）,匀浆。 ↓ 分批热处理每次20毫升，迅速升温到90℃并维持3分钟，迅速降温到10℃以下 ↓ 离心15，000rpm，30 分钟，取上清，补加CaCl2到5mM ↓ 上清加到用抽提液平衡的Phenyl-Sepharose