分子细胞生物学实验教案-生命科学学院.docVIP

生命科学学院 《》 实验教学教案 主讲教师 授课班级 学 期 《》实验教学教案 [实验项目] 实验一 [教学时数] 课时。 [实验目的与要求] 1． 2．初步掌握动物细胞PEG融合法和电融合法。 [实验原理] 22个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合，该技术对研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种和肿瘤学研究都有重要意义。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组，然后由于表面张力作用，形成一个球形细胞。 [实验材料与设备] 1、实验 2、 （1）0.85%生理盐水：氯化钠 8.5g，蒸馏水 1000mL. （2）GKN液：氯化钠 8g, 氯化钾0.4g，Na2HPO4?2H2O 1.77g，NaH2PO4?H2O 0.69g，葡萄糖2.0g, 蒸馏水 1000mL. （3）50%PEG（Mr 1 000~6 000）：将10g PEG以15磅15min高压灭菌，冷却至约500C时，加入10mL已预热至约500C的Hanks液中混匀。每瓶1mL分装，-200C保存。 Giemsa染液： ①原液：Giemsa粉1g，甘油33mL，甲醇33mL ②稀释液（PBS，pH 6.8）：Na2HPO4 4.74g，KH2PO4 4.54g，加蒸馏水定溶至1000mL ③染液：1份原液和19份稀释液混合 3、370C恒温水浴锅、倒置显微镜、无菌注射器（1ml，5ml）、试管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片等。 [方法] 一、0C冰箱保存备一周内使用。 2、用前取1mL储备液，加入5mLGKN液，1200r/min，离心5min，弃上清。重复两次，获得纯净的红细胞。 二、鸡红细胞的融合 1、将鸡红细胞用GKN液调节浓度为1×106个/mL。 2、取1mL细胞悬液离心，小心弃去上清，余下0.1mL液体，用指弹法将细胞团块弹散。 3、逐滴加入在370C预热的50%PEG溶液0.5mL，边加边轻轻摇动混匀， 370C水浴2min。 4、缓慢加入5mL Hanks液，轻轻混匀，370C 静置5min。 5、1200r/min离心5min，弃去上清，再用Hanks液洗两次，留少许溶液。 6、制片，Giemsa染液染色3分钟，镜检。 [指导与训练方案] 一、、《》实验教学教案 [实验项目] 实验一 植物原生质体的分离与融合 [教学时数] 课时。 [实验目的与要求] 一、实验目的 1.掌握原生质体分离的原理与技术； 2.了解细胞融合的基本原理及应用； 3.初步掌握PEG融合法和电融合法。 二、实验原理 植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞。原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得。但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致。原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得。原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似。但原生质体由于除去了细胞壁，所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。 2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组，然后由于表面张力作用，形成一个球形细胞。 原生质体分离融合和培养的意义： 1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路。植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。 2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。 3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 三、实验仪器与材料 1. 材料：油菜叶子、白菜花 2. 溶液或试剂：（1）洗涤液：甘露醇0.7mol/L，CaCl2·2H2O 3.5mmol/L, KH2PO4 0.7mmol/L pH 5.6 ，高压灭菌； （2）混合酶液：1.5％纤维素酶，1％果胶酶溶于洗涤液中 pH 5.6 。 （3）50%PEG （4）高pH高钙稀释液： （5）20%蔗糖溶液 （6）DPD培养基： 3. 仪器或其他用具：超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镊子、解剖刀、剪子、 接种针、铝饭盒