RT-PCR方法.docVIP

半定量 RT-PCR 方法一 反转录—第一链 cDNA 的合成 参照Promega RT-PCR试剂盒说明书进行。取2 μg植物 total RNA，与Oligo（dT）引物以0.5 ug primer/ug total RNA 的比例混合，体积不超过11 μL，70℃ 5 min，冰上冷却。加入各种反转录试剂混合： 10× reverse transcript buffer 2.5 μL； RNase Inhibitor 0.5 μL； dNTP Mixture 2.0 μL； Reverse Transcriptase 1.0 μL； RNase free Water 补足 25 μL； 混匀后，42℃ 1 h；75℃ 10 min。 PCR 合成第二链 取第一链产物0.5 μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。以拟南芥Actin7基因为反应的内标对照。 方法二 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩cDNA） 第一步：1.0 μg拟南芥总RNA和1.0 μL oligo(dT) 引物，用水稀释到总体积5.0 μL的体系，70℃加热5 min后，迅速置冰上。 第二步：在反转录作用下由随机引物引