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Western Blotting Western Blotting技术是把电泳分离的组分从凝胶相转移到一种固相支持介质上，并以针对特定氨基酸序列的特异性实际作为探针进行检测。 Western 使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 Reagents Preparation Stock Solution： 30% Acr-Bis(Acr-丙烯酰胺；Bis-甲叉双丙烯酰胺)_29.2:0.8 Acr……………29.2g Bis……………0.8g 37℃溶于60ml去离子水中，定容至100ml；确定pH＜7.0；4℃棕色瓶保存（保质期30天）。 （注意操作时戴手套） 40% Acr-Bis(Acr-丙烯酰胺；Bis-甲叉双丙烯酰胺)_37.5:1 Acr……………37.5g Bis……………1.0g 37℃溶于60ml去离子水中，定容至100ml；确定pH＜7.0；4℃棕色瓶保存（保质期30天；使用时恢复至室温且无沉淀）。 （注意操作时戴手套） 1.5M Tris-HCl ( pH 8.8) Tris-Base……………18.171g ddH2O………………80ml 溶解后，用HCl调pH至8.8；定容至100ml；灭菌；室温保存。 0.5M Tris-HCl （pH 6.8） Tris-Base……………6.06g ddH2O………………60ml 溶解后，用HCl调pH至6.8；定容至100ml；灭菌；室温保存。 1.0mol/L Tris-HCl Tris-base（MW 121.14）……………………………………30.29g ddH2O………………………………………………………200ml 溶解后，用浓盐酸调pH值至所需点（如下所示），最后用蒸馏水定容至250ml；高温灭菌后室温保存。 pH调整： pH HCl ~17ml ~16ml ~15ml ~10ml 10%（w/v）μl分装，-20℃保存；4℃保存，保存时间为一周。 0.5%（w/v）溴酚蓝 溴酚蓝……………0.0050g ddH2O……………1.0ml 溶解后，室温保存。 1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF PMSF…………………………………………………………0.174g 异丙醇…………………………………………………………100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中；-20℃保存。 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4…………………………………………………………12g 加蒸馏水至500ml；溶解后，高压灭菌，室温保存。 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO4.12H2O…………………………………………………71.6g 加蒸馏水至1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 20% Tween 20 Tween 20…………………………………………………………20ml 蒸馏水至100ml；混匀后4℃保存。 2X SDS凝胶加样缓冲液 ddH2O……………1.39ml 0.5M Tris (pH 6.8) ……………1.67ml Glycerol……………3.33ml 10% SDS……………2.67ml 0.5% Bromophenol Blue……………0.27ml 充分混匀后，933μl分装，-20℃保存；使用前加入67μl beta-mercaptoethanol。 使用时：V/V（sample/Loading Buffer=1:1）。 将protein与loading buffer按照比例加入后，95℃水浴或金属浴煮沸4min，促进SDS与protein的结合。 3X SDS凝胶加样缓冲液 去离子水……………3.55ml 0.5M Tris (pH 6.8) ……………1.25ml Glycerol……………2.5ml 10% SDS……………2.0ml 0.5%溴酚蓝……………0.2ml Beta-巯基乙醇……………50μl 充分混匀后，0.5ml分装，-20℃保存。 使用时：V/V（sample/Loading Buffer=1:2） 还原型5X SDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris.HCl pH 6.8, 0.5mol/L DTT, 10% SDS, 0.5%溴酚蓝， 50%甘油） 0.25mol/L Tris.HCl pH 6.8 2.5ml DTT（二硫苏糖醇） 0.39g SDS