LENTIEGFP.docVIP

2、Lenti-EGFP大包: 实验目的 将目的基因慢病毒表达载体与包装质粒共转293T细胞，进行目的基因的慢病毒包装。 实验材料 细胞株：293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，培养基为DMEM+10% FBS+1% P/S+1%Glutamax。 质粒载体：目的基因过表达慢病毒表达载体Lenti-IRES-EGFP；慢病毒包装质粒Mix（Gag-pol、Vsvg、Rev）； 实验步骤 1． 质粒准备： 将测序正确的Lenti-IRES-EGFP菌液划线培养，挑单克隆接入30ml 含Amp的LB，30℃摇过夜。用AXYGEN质粒中抽试剂盒进行质粒抽提，具体操作详见说明书。 测定质粒浓度：质粒DNA 最终溶于除菌的TE 中，以Thermo Nanodrop仪器测定质粒浓度及纯度，保证抽提质粒的浓度在1ug/ul左右，DNA的A260/A280 在1.8～2.0 之间。 2． 细胞准备： 转染前一天，取生长状态良好的293T细胞，弃旧培养液，加入 3 ml PBS 溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。 每皿加入2 ml 胰酶消化液，消化约2 min 直到细胞收缩、变圆，吸弃胰酶，加入3ml DMEM+ 10% FBS培养 ml DMEM+ 10% FBS， 37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养约24h。 3. 慢病毒包装 转染当天，观察细胞状态，细胞状态良好，贴壁牢，密度在50-70%时即可用于转染。 转染时，向无菌的50ml离心管中加入22.5ml Opti-MEM（1.5ml/皿×15皿），加入表达质粒90ug（6ug/皿×15皿）和包装质粒Packaging Mix 90ug（6ug/皿×15皿），混匀，室温下温育5min。 向另一无菌的50ml离心管中加入22.5ml Opti-MEM（1.5ml/皿×15皿），加入POLO 座机电话号码ul（24ul/皿×15皿） ，轻轻混匀，室温下温育5 分钟。 把稀释后的DNA 与稀释后的POLO3000混合，轻轻地颠倒混匀，室温下孵育20 分钟，以形成DNA 与POLO3000 的复合物。 取3ml 上述混合液均匀地滴加在293T 细胞的培养液中，前后左右摇匀，于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。 4、 病毒收获与浓缩 转染后48小时，收集293T 细胞上清液（第一次收液），4 ℃暂存。 细胞更换新鲜的完全培养基，继续培养至72h，收集病毒上清 第二次收液 将两次混合。 于 4 ℃，3000 rpm 离心10 min，除去细胞碎片。 以 0.45 μm 醋酸纤维素膜的滤器过滤上清液于病毒浓缩管中。 每管装36ml病毒，4°C 22000rpm 离心2h。 离心完毕后，小心取出离心管，弃上清，每管用100ul预冷的DMEM洗涤。待病毒沉淀溶解完全后收集至1.5ml EP管内后，100ul/管分装，-80°C保存。 5. 慢病毒滴度测定（荧光显微镜观察法） 感染前一天，用胰酶消化细胞并计数, 准备5×10 5细胞/ml 的293T细胞接种24孔板，每孔0.5ml。 细胞接种后第二天，根据病毒的预期滴度，准备3个无菌的EP管，10倍倍比稀释慢病毒浓缩液。 20ul 慢病毒原液 + 180 ul DMEM → 10 -1 病毒液 20ul 10 -1 病毒液 + 180 ul DMEM → 10 -2 病毒液 20ul 10 -2 病毒液 + 180 ul DMEM → 10 -3 病毒液 20ul 10 -3 病毒液+ 180ul DMEM → 10 -4 病毒液 细胞换液，每孔内加入500ul无抗生素的DMEM+10%FBS培养液，除control组外其余各孔均加入polybrene至终浓度为6 ug/ml。 各感染孔内分别加入相应稀释度的病毒液100ul，放入37℃、5% CO2的培养箱内 感染24小时后，换液，每孔内加入500ul DMEM+10% FBS+1% P/S+1%Glutamax，继续放回培养箱内进行孵育。 感染72h后观察荧光表达情况，选取合适的稀释度对应的孔，对GFP阳性的细胞进行计数，并依此计算待测慢病毒的滴度。 计算滴度： 计算感染形成单位 ifu/ml ： （平均阳性细胞数/视野）×（视野数/孔） 病毒体积（ml）×稀释倍数 因为在10倍镜下观察，24孔板 10*目镜，10*物镜 为52，加入病毒体积为0.1ml. EGFP 10-1 G EGFP 10-1 W EGFP 10-1 G EGFP 10-1 W EGFP 10-2 G EGFP 10-2 W EGFP 10-3 G EGFP 10-3 W EGFP 10-4