动物细胞培养原理.docVIP

2.2.2.2 饲养细胞制备 在杂交瘤细胞的培养过程中，融合后大量骨髓瘤细胞和脾细胞在HAT培养液中相继死亡，此时单个或少数分散的细胞不易存活，必须加入其他细胞方能使之生存，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。一般选用正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。在细胞融合前的1天制备饲养细胞。 （1） 将健康的Balb/c小鼠眼球放血后拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精中消毒3～5min，随即放入超净工作台内，腹部朝上固定于解剖台板上。 （2）用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，暴露一小块腹膜，再换把剪刀将暴露的腹膜剪一个小口。 （3）用滴管吸取适量的不完全RPMI-1640培养液注入小鼠腹腔。反复抽吸、冲洗腹腔3～4次。 （4）抽回腹腔内液体，注入离心管内。 （5）1000rpm离心10min,弃上清。 （6）先用5ml HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，做细胞计数，根据细胞计数结果，补加HAT培养液，使细胞浓度为2×105个/ml。 （7）将细胞悬液加入96孔培养板内，每孔100μl.然后将培养板置37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。 该项操作及以后的操作都必须严格无菌操作。 2.2.2.3 脾细胞的准备 （1）取已经免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球放血，并分离血清供检测抗体时的阳性对照用。同时将小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精中5min，随即放入超净台内。 （2）在小鼠腹壁上剪一小口，撕开皮肤，用灭菌镊子提起腹膜，剪开左侧腹膜及肋骨，暴露脾脏，换用另一套灭菌器械，用镊子提起脾脏，分离结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，轻轻冲洗一次。 （3）再将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中，再冲洗一次，然后用剪刀剪碎。 （4）将脾脏碎块装入匀浆器中，充分研磨。之后用不完全培养液冲洗匀浆器，待大的组织块沉降后，吸取上层的细胞移入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀。 （5）1000rpm离心5min，弃去上清。 （6）沉淀细胞再用不完全培养液同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬至10ml，混匀。 （7）取脾细胞悬液活细胞计数后备用。 2.2.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的准备 骨髓瘤细胞的状况直接影响融合结果，生长良好的细胞透亮，边缘光滑清晰。 （1）在细胞融合前一周左右复苏SP2/0骨髓瘤细胞，并在细胞融合前36～48h将骨髓瘤细胞扩大培养。使细胞在融合时正处于对数生长期。一般融合一次用的细胞数是长到95%左右的75mm2培养瓶4-5瓶。 （2）融合时将SP2/0骨髓瘤细胞从瓶壁上吹下，收集于50ml离心管内。 （3）1000rpm离心5min，弃去上请。 （4）用不完全培养液混悬细胞后活细胞计数，取所需细胞数，用不完全培养液洗2次，以10ml不完全的RPMI-1640培养液悬浮备用。 2.2.2.5 细胞融合 将已制备好的脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞混合于灭菌的50ml离心管中，两种细胞之比为10：1，1000rpm离心8min，弃上清，重复上述离心一次后尽量弃去上清。用手指轻轻弹击离心管底部，使沉淀的细胞松散均匀。将离心管倾斜，一手均匀地转动离心管，另一手用1ml吸管匀速加入1ml 37℃预热的50% PEG，从加入到加完的时间控制在60s左右，边加边搅拌。加完后，慢慢摇晃30s，再 静置60s。立即在随后的5min内加入10ml预热的37℃不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。在第一分钟和第二分钟分别加1ml，第三分钟和第四分钟分别加入2ml，第五分钟将剩余液体加完。边加边轻轻搅动使PEG和终止液充分混合，动作应轻柔。随后再补加30ml不完全培养液，800rpm离心6min，弃去上清，加入10ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。根据所用96孔培养板的数量，按一块96孔细胞培养板10ml计算补加完全培养液之所需量。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，每孔100μl.，37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。 融合后的第三天更换培养液一次，换液时吸去1/2培养液，加入等量新鲜HAT培养液。以后每隔两天换液一次。观察骨髓瘤细胞都死后，大约第七天左右可以换用HT培养液。仔细观察融合细胞的生长状况，凡有污染的孔应立即滴加1%的NaOH，以免污染扩散，如果细胞生长太慢可补加1次饲养细胞。 2.2.2.6 杂交瘤细胞的筛选 融合后，一般过七天开始寻找并记录杂交瘤的生长情况，当杂交瘤细胞长至一个视野的一半以上时，可用建立好的间接ELISA方法检测抗体分泌情况，筛选阳性克隆。取细胞培养上清100μl加入已包被好抗原的酶标板中，细胞培养孔补加100μl培养液，其中两孔加入SP2/0培养上清作为阴性对照。两孔加入稀释1000倍的多抗血清作为阳性对照，被检测孔OD值大于阴性孔4倍以上判定为阳