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改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。 确定最佳的溶剂强度 “试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳了。 采用梯度洗脱的实验方法，即在20min内，高强度的溶剂的比例从5%增加到100%，找出在梯度洗脱期间，流出峰到达中点的时间tx 即流出的第一谱峰与最末谱峰之间的中心点 ，然后用下式计算合适的流动相离开梯度混合器的时间tk tx-2t0-tD. t0为死时间，tD为溶剂由梯度混合器流出，通过泵和所连管线到达柱子的时间 最佳溶剂强度时溶剂浓度%： 初始浓度（%）+tk/20[最终浓度-初始浓度] 柱类型与温度选择性的关系 . 柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度。 色谱柱条件 流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。 其他因素 工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好 液相色谱贮液器的使用及维护 常用干净的无水甲醇试剂瓶作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但瓶盖与导管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器，即沉子，孔径为10μm，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管的重物，使导管能沉在并底。 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用0.2μm膜过滤。 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。 溶剂脱气 脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用 流动相不畅的原因 原因 管路阻塞 长了霉菌 管道有大量气泡造成空化 贮液并盖子太紧 解决方法 更换管路 用稀硝酸洗去管内微生物（洗前必须洗净醇类） 采用色谱的空灌注和湿灌注 抬高贮液并或向并内加压去掉沉子 色谱柱使用及维护（一） 在使用前一定要注意看使用说明，了解柱子的使用范围如pH值等，一般来说，硅胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。 温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃；5μm柱，＞70℃。 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。。 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器，若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降40～60％）。 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） 避免流动相组成及极性的剧烈变化 压力升高是需要更换预柱的信号 色谱柱使用及维护（二） 用高质量溶剂和水作流动相。 流动相脱气 每天结束时，先用水洗，再用甲醇洗。若用过缓冲液：必须先水洗30～60min 1ml/ min），再甲醇洗30min，千万不可先用甲醇冲洗，否则无机盐沉淀堵了管路 分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质，建议用90％甲醇冲洗30～60min；若分析用流动相中含以上物质，要先用10％甲醇（或用与分析用流动相同比例，把含酸、碱、盐溶液换成水）冲洗1小时左右，再梯度走到90％甲醇冲洗30～60min（若用多元泵）。有必要时再循环几次，可以适当缩短时间。若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存。 及时换密封圈 防止色谱柱堵塞的问题1：溶剂中的不溶物—应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm）2：样品中的不溶物—应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm）3：柱内不溶物的形成：由于溶剂的不互溶而产生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱；在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀—检查样品液和流动相是否互溶；由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀—将色谱柱密封紧，并保持室温恒定！。 色谱峰保留时间问题: 保留时间飘忽不定 各次运行之间 系统不稳定或未达化学平衡 泵压力不稳 泵头里有气泡 进样体积过大或