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临床PCR检验流程记录表 2008.10 检验日期： 检验项目： 扩增仪中保存文件名 使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。④Lightcycle 扩增仪中结果保存于D盘对应实验日期的文件夹中，如2008年9月的结果保存于“D：\2008\09\”中，每月底将当月资料备份于软盘中，保存2年。 实验前准备 □试剂在有效期内 □扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年） □生物安全柜的滤膜在使用有效期内 □离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 □各区按SOP配制含氯消毒液含氯消毒液操作者口生物工程有限公司 口 不正常按SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 □ 按处理SOP处理实验废弃物。操作者 检验日期： 检验项目： 样本处理区 实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 □实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱温度：冷藏室（2～8℃） ℃； 冷冻室（-20±2℃） ℃ 实验室温度 ℃（允许范围：15～30℃）；相对湿度： （允许范围：30%～70%） HBV-DNA阳性室内质控物来源： 浓度及批号： 扩增位置： HBV-DNA阴性室内质控物来源： 批号： 扩增位置： HCV-RNA阳性室内质控物来源： 浓度及批号： 扩增位置： HCV-RNA阴性室内质控物来源： 批号： 扩增位置： 所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置： 1 9 17 25 2 10 18 26 3 11 19 27 4 12 20 28 5 13 21 29 6 14 22 30 7 15 23 31 8 16 24 32 所处理的HCV-RNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置： 1 9 17 25 2 10 18 26 3 11 19 27 4 12 20 28 5 13 21 29 6 14 22 30 7 15 23 31 8 16 24 32 核酸提取及加样过程：□按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。 □按丙型肝炎病毒RNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。 仪器设备使用： 生物安全柜： □正常 □不正常； 恒温金属浴： ℃； 离心机： □正常 □不正常； 振荡器： □正常 □不正常； 低温离心机：制冷：□正常 □不正常； 离心：□正常 □不正常 实验后： □ 按SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 □ 按处理SOP处理实验废弃物。口冷冻操作者按SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 □ 按处理SOP处理实验废弃物。操作者n*2ul 计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。 加样（样本处理区） 吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 4. RT-PCR反应（检测区） 4.1 循环条件设置 Program Cycles Temperature摄氏度 Incubation Time min:sec Temperature Transition Rate 摄氏度/sec Acquisition Mode Analysis Mode 1 1 50 30:00 20 None None 2 1 95 15:00 20 None None 3 45 95 00:05 20 None Quantification 50 00:30 20 Single 72 00:20 10 None 反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。 仪器检测通道选择 选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。 样本的设定 在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。 结果分析条件设定 对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。 分析方式选择Fit Points，基线调整选