牛流行熱疫情監控及免疫適期之探討.docVIP

2002年牛海綿狀腦病及狂犬病 李淑慧* 張國慧 蔡國榮 丁履紉 蕭終融 林士鈺 行政院農業委員會家畜衛生試驗所 摘要 bovine spongiform encephalopathy, BSE 及狂犬病 rabies 免疫病理學診斷技術，並撰寫牛海綿狀腦病及狂犬病兩種疾病標準操作手冊 Standard Operation Procedure; S.O.P 。2002年共監測647例30月齡以上牛腦，其平均年齡為4.2歲，製備1,385件牛腦組織切片，檢體分別來自屠宰場、結核病撲殺場與送檢病例之牛隻，採樣地區包括桃園、台中、彰化、雲林、南投、台南、屏東、宜蘭、台東、澎湖及金門等十一縣，結果皆無牛海綿狀腦病特異病變。另以酵素連結免疫吸附法及西方免疫墨點法檢測647例牛腦，及回溯以往四年90例牛腦組織，亦未發現異常之普里昂 prion 蛋白質。此結果可提供作為世界動物衛生組織評鑑我國為非疫區之用。應用組織病理學、直接免疫螢光標示抗體檢查法及免疫組織化學染色技術檢測56例犬腦組織，結果皆未檢測出狂犬病抗原。另利用酵素連結免疫吸附法檢測4,317件犬隻血清中狂犬病抗體，其中家犬佔1,946件，陽性率為41.0%，%。 關鍵字、緒 言 BSE及rabies之實驗室生物安全、[1,2,3,14]。本報告將已建立之牛海綿狀腦病及狂犬病實驗室診斷方法詳加說明，並報告目前之監測結果。 材料及方法 除以組織病理學檢查外，BSE需配合免疫組織化學染色法或西方免疫墨點法或酵素連結免疫吸附法等其中一種檢驗方能進行確診，rabies則需配合直接免疫螢光標示抗體檢查法、免疫組織化學染色法及病毒分離結果進行確診，茲將已建立之實驗室診斷與監測方法詳述如後： 一、組織病理學診斷 　?BSE組織病理學診斷 將採集的牛腦組織置於10 % 中性福馬林液固定完全後，取大腦、小腦及腦幹共十個部位的腦組織。本病重點部位為延腦 medulla oblongata 成”V”字形尖端的閂 obex [15,19]，將之修整成約4 mm的厚度，放入脫水包埋盒中，再浸泡於98%的蟻酸中1小時 將具感染能力的prion不活化 ，然後轉置10%中性福馬林液中2天。最後依一般例行之病理切片方法，將組織塊脫水、石蠟浸潤、石蠟包埋等步驟，製作成3-5 m厚之切片，脫蠟後以HE染色及封片，於顯微鏡下觀察各部位腦組織切片中的病理變化。Rabies組織病理學診斷 本法是以傳統的組織病理診斷方法將腦組織製作成石蠟包埋組織切片，經HE染色於顯微鏡下觀察各部位腦組織切片中的病理變化來診斷狂犬病，並以特殊染色 Mann’s method來染腦神經元細胞質內狂犬病特異性之病毒包涵體－奈格利小體 Negri bodies [11,17,18] 圖3 。 1.%中性福馬林液中24至48小時 為求固定良好，組織之厚度以不超過1公分為原則 。3-5 m厚之切片。脫蠟後以HE染色於顯微鏡下觀察各部位腦組織切片的病理變化。 2.奈格利小體之染色 Mann’s method ：組織切片如常規進行脫蠟後，於室溫下置於甲基藍染色液中24小時。取出切片水洗再置於1.5%氫氧化鈉酒精溶液10分鐘，使切片染成粉紅色判讀之。動物若有狂犬病感染，可在神經元細胞質內觀察到狂犬病特異性之病毒包涵體－奈格利小體 Negri bodies ， 3.直接免疫螢光標示抗體檢查法 Direct immunofluorescent test 本法是狂犬病最快速且準確的標準診斷方法，各國狂犬病診斷實驗室對疑似狂犬病的動物檢體皆採用本檢查法，[11,17,18]。本法是將感染動物的腦組織作成捺壓片後，以FITC fluorescin 螢光標示之狂犬病單株抗體來染色，該標示抗體若與狂犬病抗原結合後會形成抗原抗體結合體，在螢光顯微鏡下被紫外光源照射激發而發出綠色螢光 圖4 ；若檢體沒有狂犬病抗原則不會被染色而不具螢光。 二、免疫組織化學染色法 immunohistochemistry, IHC 　?BSE免疫組織化學染色法 利用對prion蛋白質特異性的單株抗體及免疫染色技術來偵測牛腦組織中的異常的PrPSc [7,8]。 來源：分讓自美國肯德基州立大學之羊搔癢症病例切片 。%、%、%、%酒精，最後用蒸餾水洗，每步驟浸泡3分鐘。進行脫蠟後，以磷酸鹽緩衝液 0.1M phosphate buffer solution, pH7.2, PBS 洗3次，每次5分鐘，然後置於蛋白K溶液37℃15分鐘。bar 121℃高溫高壓滅菌器中20分鐘後，PBS洗3次，每次5分鐘，然後置於甲醇-雙氧水溶液中5分鐘以去除內源性過氧化，再以PBS洗3次，每次5分鐘。取出切片，組織周圍以無塵拭紙吸乾水分，置於保溼盤中，在