实验三小白鼠骨髓染色体制备.pptVIP

三、实验材料、仪器和试剂 材料：小白鼠（22～25g ）。 仪器：显微镜、注射器、10ml离心管、吸管、 试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、 剪刀、磁盘、镊子等。 试剂：秋水仙素、KCl、磷酸缓冲液、冰醋 酸、甲醇、Giemsa液等。 * * * 实验三? 骨髓法制备小白鼠 染色体标本 第二部分 细胞遗传学 一、实验目的 1、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方 法及操作技术。 2、进一步观察了解畜禽染色体的形态学及 遗传学特征。 在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，通过注射秋水仙素使正在分裂的细胞停止在有丝分裂中期，再经过低渗、固定、滴片就可以获得大量的骨髓细胞染色体分裂相。 二、实验原理 1、研究染色体的材料 处于分裂旺盛期的组织： （1）动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。 （2）果蝇三龄幼虫的唾腺 （3）植物的根尖（如洋葱） 2、研究染色体的方法 1、材料获取 直接获取细胞（骨髓、唾腺） 细胞培养（猪淋巴细胞培养法） 2、非切片法 滴片法－－细胞培养材料、骨髓 压片法－－果蝇唾腺，植物的根尖 { { 1、秋水仙素处理：取骨髓前2～3h，给小白鼠腹腔注射秋水仙素液（注射剂量为2μg/g小白鼠体重） 四、制备步骤 2、杀鼠取髓： 采用脱颈椎法处死小白鼠。用剪刀剪开后腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，剔净皮肉，再用剪刀剪掉股骨两端，用注射器分两次吸取0.075MKCl溶液（共5ml）通过针头注入骨髓腔缓慢将细胞冲入离心管，反复冲洗直到骨髓腔发白为止。 注意事项： 注射器 剪掉 剪掉 3、低渗：将获得的骨髓悬液用吸管立即将细胞团吹散打匀，两组同时放入37℃恒温水浴锅内低渗30min。低渗结束时，向试管中加入加预固定液（甲醇：冰乙酸＝3:1，现配现用）8～10滴 ，混合均匀（以防细胞结团），平衡（注意2管同时离心）后1000r/min离心10min，弃上清。 4、第一次固定：在弃去上清液的试管中。 加入新配的3:1甲醇冰醋酸固定液5~6ml，用吸管轻轻吸打均匀，室温静置30min进行第一次固定。平衡后1000r / min离心10min，弃上清（可留0.5ml） 。 5．第二次固定：在弃去上清液的试管中。加入新配的3:1甲醇-冰醋酸固定液5~6ml，用吸管轻轻吸打均匀，室温静置30min进行第二次固定。平衡后 1000r / min离心10min ，弃上清（留0.2ml左右） 。 6、滴片：在弃去上清液的试管中加入适量（2～10滴，在老师辅导下加）新配固定液，用吸管吹打均匀制成细胞悬液，滴2～3滴于冰冻的载玻片上，立即用嘴吹气使细胞迅速分散，在载玻片后面一角写上学号，空气干燥。 7、染色：将染色体制片细胞面朝下反扣于染色板上，用1：9Giemsa稀释液染色30min，小水流自来水冲洗浮色，空气干燥后，显微镜下观察。 小白鼠睾丸细胞分裂10倍物镜下 小白鼠的染色体分裂相（2n＝40） 五、骨髓法需要注意的问题 1、秋水仙素的量一定要合适，太少分裂相少，太多染色体短粗。 2、为了节省时间，可直接用低渗液（约5ml）冲骨髓入离心管。 3、注意将两组离心管同时放入水浴锅中，由1人记录时间，同时进行预固定，然后离心。 4、低渗时间一定要严格时间,加预固定液8滴，混合均匀平衡离心（注意2人一组同时离心） 低渗的作用？ 目的是使低渗液在一定温度、一定时间内渗入细胞内，使细胞涨大，细胞膜变薄，在滴片时细胞才能破裂，染色体才能平铺在载玻片上。 实验证明小鼠和雏鸡都用37℃ 20～21分钟最好。 预固定的作用？ 在低渗结束后，往细胞悬液中加入甲醇：冰醋酸（3：1）约1ml，可以使细胞表面轻微固定，以防止细胞结团。 固定的作用？ 为了除去染色体中的蛋白质，使得染色体分散良好清晰可见，在实验中如果发现分散不够好，可采取延长固定时间或用甲醇：冰醋酸=3:1再固定一次可以改善染色体分散情况。 六、作业 1、 每个人完成一份实验报告，写明实验目的、原理、材料器具试剂、步骤、绘出你所做的染色体标本图形。 2、如失败，请分析失败的可能原因。 3、请对本次实验提出改进意见，并写出实验体会。 *