玻璃化冷冻及质控-ZXY.docVIP

玻璃化冷冻技术 卵母细胞的玻璃化冷冻及复苏 【适应症】 取卵日丈夫精液和/或睾丸组织中未见可用精子，建议冻存全部卵母细胞；若精子质量极差，可疑受精困难，向患者充分交待病情，知情同意的原则下可考虑冻存部分卵母细胞； 取卵日患者获卵数 20，自愿冻存部分卵母细胞留待捐赠或自用 丈夫患有某些疾患（如梅毒、丙肝潜伏期或感染期、携带者）不适宜冷冻胚胎者，如获卵数 12，建议冷冻部分卵母细胞 【冷冻操作流程】 1 签署卵母细胞冷冻知情同意书 2 将玻璃化冷冻液置于室温下30分钟后使用，同时准备好冷冻载体、支架，标记清楚； 3 将待冷冻的卵母细胞脱颗粒细胞，尽量剥除干净 4 室温下将2-4枚成熟卵母细胞置于冷冻液1中3-5分钟，然后迅速转移至冷冻液2，在1分钟内将卵母细胞置于冷冻载体上，迅速浸入液氮，装管，保存。 【复苏操作流程】 核对卵母细胞冷冻保存知情同意书，如为捐赠卵母细胞，必须具有赠卵知情同意书； 将玻璃化冷冻复苏液置于室温下，30分钟后使用； 按照冷冻卡片找到胚胎在液氮罐中的位置，取出冷冻管放入装有液氮的保温桶内。确认标本无误； 将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有卵母细胞）浸于warming液中，显微镜下寻找卵母细胞，找到后迅速转入T1液中，室温放置3分钟，再依次转入T2，washing液中各3分钟，挪入事先准备好的培养滴； 3h后行ICSI 囊胚的玻璃化冷冻及复苏 【冷冻标准】 D5或D6，3BB以上囊胚 【冷冻操作流程】 1 将囊胚玻璃化冷冻液置于37℃预热，30分钟后使用，同时准备好冷冻载体、支架，标记清楚； 2 37℃下将1-2枚囊胚置于冷冻液1中2分钟，然后迅速转移至冷冻液2，在30秒内将囊胚置于冷冻载体上，迅速浸入液氮，装管，保存。 【复苏操作流程】 核对囊胚冷冻保存知情同意书； 将玻璃化冷冻复苏液置于37℃，30分钟后使用； 按照冷冻卡片找到胚胎在液氮罐中的位置，取出冷冻管放入装有液氮的保温桶内。确认标本无误； 将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有囊胚）浸于T1液中，显微镜下寻找囊胚，37℃放置2分钟，再依次转入T2 3分钟，washing液中5分钟，然后挪入事先准备好的培养滴； 2h后观察囊胚扩张情况，评价损伤及移植价值。如2h后仍未扩张建议培养24h再观察，如仍未扩张，放弃移植。 实验室质控 进入实验室后检查记录实验室温度（21－25℃）、湿度（40－60%）、检查层流开启状态及培养箱一般情况（温度37、CO2显示值5-6%、水盆） 每日工作结束后必须检查，填写 每周用CO2检测仪检测、核对培养箱CO2浓度（标准？）；核对并记录培养箱温度；二周一次对培养箱进行定期消毒， 每批次的培养液及耗材必须有到货时间、使用时间记录，新批次培养液必须检测行血气分析；新耗材、培养箱、培养液必须经过精子生存实验 5．精子生存实验 ?用上游法分离活动性良好的精子。调整活精浓度5-20×109 /L；取0.5ml精子混悬液，置入5ml培养管或培养皿内，做为实验管，取0.5ml精子混悬液置另一个培养管及培养皿内，做为阴性对照管；将待检测的各种耗材置于试验管（皿）内，室温下放置4天后，用Makler计数器或红血球计数器计数试验管及对照管内的活动精子，并计算它们之间的生存指数。 生存指数 试验管内活精/对照管内活精×100% 如果生存指数小于75%，就应考虑可能有细胞毒素的存在。 注意：1）4天后阴性对照管精子存活率应大于50%； 2）实验时可设立阳性对照，即在精子混悬液中加入橡胶手套碎片，培养4天后精子应全部死亡； 3）只有阴性对照、阳性对照结果均正常情况下，试验结果方有效，生存指数 75%方可通过； 4）如果一次精子生存实验未通过，应再次重复，3次实验中至少2次通过方可使用； 6. 定期检测实验室压差，更换滤膜（初效：1－2月；中效：2－4月；亚高效：1年；高效：3年） 7. 实验室新来人员培训：所有培训应有记录，在带教老师指导下操作?例后，经过实验室考核后方可独立操作 8. 数据反馈：每周统计受精率 70% 、卵裂率（ 98%），每月及时总结临床妊娠率，着床率并反馈,（固定培养箱、培养液）