土壤酶活活性测方法.docVIP

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法 （一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。 （二）试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克 和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液 （三）测定步骤 （1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 土壤中脲酶活性的测定以每克土壤在24h内酶解释放的NH3-N 的表示活性 土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法 方法原理本法基于以精胶为基质，解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。 试剂1%精胶甲苯铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水②64.5g Na2HPO4·12H2O溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。甘氨酸标准溶液的配制取 267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至 1 L （1mL含50μg NH3-N）。操作步骤取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时以水代替基质作为对照。培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL铜-磷酸盐溶液20mL。显色后，用分光光度计在650nm处测定NH3-N含量。以每克土壤在37℃24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性 土壤磷酸酶测定磷酸苯二钠原理基质，酚氯代二溴对苯醌亚胺表示磷酸酶活性。试剂配制0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 26-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；酚的标准溶液：酚原液取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；甲苯；0.3％硫酸铝溶液。操作步骤标准曲线绘制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。30min后比色测定。绘制标准曲线。 称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL 0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。后于培养液中加100mL 0.3％硫酸铝溶液并过滤。吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在风光光度计上于660nm处比色。磷酸酶活性，以37℃下24h后1g土壤中释放处的酚的毫克数表示。蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法 （一）方法原理 蔗糖酶酶解所生成的还原糖与?3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关