WesternBlot配方与方法.docVIP

Western Blot 觉得割胶用电话卡很容易割破，然后剪膜目测真的好难，膜的蛋白面不好判断不知道有没有好的方法？ 配胶：先配分离胶，再配浓缩胶。（物品大部分在新冰箱4度，用完最好尽快拧紧放回） 我们实验室常配的 （单位均为ml） 分离胶 10ml 分离胶15ml 浓缩胶 2ml 浓缩胶 4ml 超纯水 2．0 3．0 1．4 2．7 30％Acr/Bic（丙烯酰胺） 4．0 6．0 0．33 0．67 1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 3．8 5．7 1 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0．25 0．5 10％SDS 0．1 0．15 0．02 0．04 10%APS（过硫胺酸） 0．1 0．15 0．02 0．04 TEMED 0．004 0．006 0．002 0．004 注意：TEMED量很少，所以要注意观察有没有吸上来，也要注意不能插太深，防止枪头壁上粘太多 步骤：.样品制备1．培养细胞或药物处理。2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。4．超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。5．煮沸样品5 minutes。6．离心 12000g, 5 min，取上清。7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至 SDS胶 ( 10 cm x 10 cm)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min， 14000g离心15min（ 4），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 3）膜放入两层保鲜膜中（之前可稍微在滤纸上吸干），保鲜膜在曝光夹内。 4）放上胶片，合上曝光夹 5）3-5Min后用镊子拿出胶片 开红灯，把胶片放入显影液内，不时观察有无黑色的条带出来。到显影完全，转入水中洗净，转入定影液，这个不需要多久的，然后转入水中。回收显影液定影液，胶片晾干。 注意事项： 最常见的问题是背景信号过高。处理：进一步稀释一抗；使用含有去污剂的封闭缓冲液；使用其他封闭试剂，如牛血清白蛋白；减少蛋白上样量 所有步骤均要使用去离子水。 手上的油脂会影响蛋白的转移，操作时应戴手套。 某些抗体会由于去污剂的存在而不与蛋白结合。 附录参考 1．配胶：一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶，而积层胶放4℃，等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整） 2ml 5%积层胶 3ml 5%积层胶 5ml 8% 分离胶 5ml10% 分离胶 10% 两块胶 5ml15%分离胶 超纯水 1.4 2.1 2.3 1.9 2.85 1.1 30％Acr/Bic 0.33 0.495 1.3 1.7 2.55 2.5 1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 1.3 1.3 0.95 1.3 1 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0.25 0.375 10％SDS 0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 10%APS（过硫胺酸） ,现配现用 0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 TEMED 0.002 0.003 0.003 0.002 0.003 0.002 2． 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29配制时，SDS有效分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。 附录配液： 10% SDS溶液(/v)： SDS 0.1g DDH2O 1ml 加热溶解，室温保存m