平滑肌细胞原代养、传代、冻存方法及所需试剂.docVIP

01年 中国现代医学杂志 贴壁法原代培养 1.1　细胞培养 1.1.1　培养液配制　DMEM(美国公司)Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素 (100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,)。 1.1.2　培养器皿　25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。 1.1.3　大鼠血管平滑肌细胞培养　动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。每次取材2~3只大鼠。贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶