SIAH1与Bim在乳腺癌中的表达及意义doc.docVIP

附件2 论文中英文摘要格式 作者姓名：温媛媛 论文题目：SIAH1与Bim在乳腺癌中的表达及意义 作者简介：温媛媛，女，1982年2月出生，2005年8月师从于中国医科大学病理学教研室宋敏教授，于2010年7月获博士学位。 中 文 摘 要 前 言 乳腺癌是女性一种常见的恶性肿瘤，已成为女性死亡的主要原因。乳腺癌的发生经历了以下几个阶段：正常—普通导管增生—不典型增生—导管原位癌—乳腺浸润性导管癌，探讨与乳腺癌动态发展过程相关的基因对治疗乳腺癌具有重要意义。 SIAH家族蛋白是果蝇属SINA蛋白的同系物，人类有两个高度保守的同源SINA：SIAH1和SIAH2，siah1定位于16q12号染色体，编码282个氨基酸，与果蝇属sina有76﹪的氨基酸相似，siah2定位于3q25号染色体，编码了324个氨基酸，与果蝇属sina有68﹪的同一性，与siah1有77﹪的同一性。然而SIAH1和SIAH2蛋白在N端有显著差别。SIAH1蛋白具有E3泛素连接酶的活性，可调节一些蛋白的泛素化和降解，这些蛋白包括?-catenin，c-myb，APC和SIAH1本身。SIAH1可作为一种肿瘤抑制因子发挥生物学作用，研究发现SIAH1在肝癌细胞系中低表达且过表达SIAH1后可诱导肝癌细胞的凋亡。乳腺癌细胞过表达SIAH1后可通过改变有丝分裂来抑制细胞生长和诱导细胞凋亡。还有研究表明SIAH1可以在p53依赖和独立的细胞凋亡和肿瘤抑制细胞模型中表达。 Bim (Bcl-2 interacting mediator of cell death) 是Bcl-2 家族中BH3-only 亚家族的成员，是一种重要的凋亡调节蛋白。现已明确，Bim分子在一定的凋亡刺激下被激活，活化的Bim分子即可通过与Bcl-2/Bax的相互作用激活Bax，从而引起线粒体途径的细胞凋亡。 最近有研究发现SIAH1可能通过JNK/c-jun途径来调节细胞凋亡。JNK信号通路在细胞应激和细胞凋亡中起重要作用，且JNK可通过调控Bim的表达来诱导细胞凋亡。所以我们推测SIAH1可能通过JNK通路来调控Bim，从而诱导乳腺癌细胞的凋亡，但上述假设是否成立？其具体机制如何？这些问题需要我们进一步研究证实。 本研究目的旨在探讨乳腺组织中SIAH1和Bim的表达情况及与临床病理学参数的意义。在细胞水平上，通过过表达和干扰SIAH1，观察其对Bim表达，MAPK信号通路活性及对乳腺癌细胞凋亡和生长侵袭能力的影响。 材料与方法 1、乳腺组织 本研究选取了231例乳腺组织标本（包括40例正常乳腺组织，53例乳腺不典型增生组织，36例乳腺导管原位癌组织和102例乳腺浸润性导管癌组织），均来自中国医科大学附属第一临床学院2005-2008年肿瘤外科手术切除的标本，所有患者术前均未接受放、化疗。标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，HE常规染色后明确诊断。其中部分癌旁乳腺组织（远离肿瘤至少5厘米）和癌组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。 2、免疫组织化学染色及结果判定 标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4μm切片，经脱蜡，脱苯，水化后，采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测SIAH1和Bim蛋白表达。多克隆抗体SIAH1和Bim4℃孵育过夜。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定：SIAH1和Bim以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野（×400）下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数，按SIAH1和Bim表达百分率分为以下四个等级： 0%为0分，1%-50%为1分，51%-75%为2分，75%为3分。根据免疫组化染色强度分为三个等级：浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分4者判定为阴性，积分≥4为阳性。 3、细胞培养 用含10%新鲜胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2的条件下培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7，人乳腺正常上皮细胞系MCF7-10A。 4、Western Blot 在收集的细胞内加入裂解液充分裂解，低温高速离心（4℃，12000转/min，30min），提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60μg。电泳（12%SDS凝胶）、转印、封闭，一抗SIAH1（1:400）、Bim（1:1000）、JNK（1:1000）、p-JNK（1:1000）、ERK（1:400）、p-ERK（1:400）、p38（1:400）、p-p38（1:400）和β-actin（1:200），4℃孵育过夜，分别与各自对应的二抗（1:4000）室温孵育2小时，ECL显色，结果经自动凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。 5、RT-PCR