第7章 原核表达.ppt

三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 工程菌遗传不稳定性的表现形式 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致 其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing） 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 工程菌遗传不稳定性的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 重组质粒的逃逸率 一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中 称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（ 吖啶）促使重组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒 拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧 改善基因工程菌不稳定性的策略 改进载体受体系统 以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以 选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死 性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合 蛋白编码基因 改善基因工程菌不稳定性的策略 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营 培养基复杂，成本较高 养组份 改善基因工程菌不稳定性的策略 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 四、举例 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 胰岛素的结构及其生物合成 S S S S C N S S B 肽（30） C 肽（31） A 肽（21） R R R K S S S S C N S S N C 高尔基体内的特异性肽酶 N C 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 人胰岛素的生产方法 直接提取法制人胰岛素 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： 早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料 供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临 床需求。 人胰岛素的生产方法 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。 这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产 成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。 人胰岛素的生产方法 化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素 与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人 的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种 选择。 上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催 化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B 链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙 酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60% 但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。 人胰岛素的生产方法 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛 素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司 又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合 性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代 动力学