生化(一)实验义(生物技术).doc

实验一、血红蛋白吸收光谱的测定 溶血液的制备 擒拿固定小白鼠，用手术镊摘除其一只眼球，取眼底血2滴于10ml蒸馏水（D.W）中，混匀。 吸光度测定与A-λ曲线的绘制 取两只比色皿，分别装入蒸馏水、溶血液，在波长（λ）520nm~600nm的范围内，每次均以D.W调零，用分光光度计测溶血液吸光度A值，再在坐标纸上绘制A-λ曲线，并找出λmax值。 λ 520 525 530 535 537 539 541 543 A λ 545 550 555 560 565 568 570 572 A λ 574 576 578 580 585 590 595 600 A ▲注意事项： 1.λ的选择原则：远离吸收峰时，间隔5nm；靠近吸收峰时，间隔2nm。 2.溶血液的A值在0.2~0. 8之间与溶血液的浓度线性较好。 3.氧合血红蛋白在波长为541nm、577nm、404nm、280nm及210nm处有峰值；还原血红蛋白在波长555nm处有峰值。本次实验对象为氧合血红蛋白。 4.在A-λ曲线中描出λmax1、λmax2，并写出具体波长值。 三、结果及结果分析 实验二、蛋白质性质实验 一、等电点（pI）测定 1、操作及结果 1号管 （pH=5.9） 2号管 （pH=5.3） 3号管 （pH=4.7） 4号管 （pH=4.1） 5号管 （pH=3.5） 0.01mol/L醋酸 0.3 — — — — 0.1mol/L醋酸 — 0.15 0.5 2.0 — 1mol/L醋酸 — — — — 0.8 D.W（ml） 4.2 4.35 4.0 2.5 3.7 混匀，各加入0.5ml酪蛋白液，混匀，静置，观察浑浊度。 10min后的浑浊度 30min后的浑浊度 2、注意事项： （1）观察颜色、浊度采用白色背景。 （2）pH≈pI时，试管中底部沉淀最多，上端较清亮。 3、结论 二、茚三酮反应 1、操作及结果 1号管 2号管 5%鸡蛋白溶液（滴） 5 — D.W（滴） — 5 0.1%茚三酮（滴） 2 2 摇匀，微火加热煮沸1~2分钟，冷却后，观察结果。 结果 2、注意事项： 加热用外焰；防局部高温；防爆沸。 3、结论 实验三、血清总蛋白测定 1.原理：双缩脲反应 2.操作：用对比法测定。 空白管（B） 标准管（S） 测定管（T） D.W 50μl — — TP标准液（43.8g/L） — 50μl — 血清 — — 50μl 双缩脲试剂 2.5ml 2.5ml 2.5ml 混匀，室温30min后，540nm以空白管调零，测定标准管、测定管吸光度AS、AT 3.计算：血清TP含量（g/L）=（AT/AS）CS，其中CS =70g/L 4.成人血清参考范围：60~80g/L 实验四、血清白蛋白测定 1.原理：溴甲酚绿法（BCG法） pH4.2 BCG + Alb 草绿色复合物 黄色 pI=4.7 λmax=630nm 2.操作：用对比法测定。 设置试剂空白、标准对照（CS=43.8g/L），按样品与试剂比=10μl∶2ml加样，室温10min，630nm测AS、AT，再计算血清Alb的含量。 3.计算：血清Alb含量（g/L）=（AT/AS）CS，其中CS =40g/L 4.成人血清Alb参考范围：35~55g/L 实验五、ATP纸电泳 操作 1、点样：取15cm滤纸一条，距一端约6.0cm处用铅笔划一基线，用点样管吸取样液10μl，分三次将样液轻轻点在滤纸基线上，边点样边用电吹风冷风吹干。 电泳：将点样滤纸平铺在电泳支架上，点样端靠近负极（因为ATP的pI＜缓冲液pH），滤纸完全被缓冲液浸湿后，调电压至200V，电泳30min，关电源，吹干。 荧光观察：将吹干的滤纸在紫外灯253.7nm下观察，用铅笔划出荧光斑块，贴在实验报告上。（激发波长为253.7nm。该仪器操作时与“点样”、“365A”按钮无关） 二、结果及结果分析 实验六、酶的竞争性抑制 操作及结果（体积：滴） 1号管 2号管 3号管 肌肉靡 10 10 — D.W 10 — 20 5%丙二酸 — 10 — 3%琥珀酸 10 10 10 0.02%甲烯蓝 2 2 2 处理 各管摇匀 石蜡油（加后不再摇） 8 8 8 观察