越南Kon Tum省实施「少数民族橡胶种植计画」可行性之研究.docVIP

愛德華氏菌 Edwardsiella ictaluri 3–磷 酸甘油醛脫氫酶蛋白之分子選殖、表現及對愛德華氏菌之疫苗效力評估 Molecular Cloning, Expression and Vaccine Efficacy of Glyceraldehyde–3–Phosphate dehydrogenase GAPDH Protein from Edwardsiella ictaluri against Ewardsiellosis 研究生：高成中Cao Thanh Trung 指導教授：陳石柱 Chih-Chu, Chen Ph.D. ; 楊忠達 Chang-Dar, Yang Ph.D. 【摘要】 根據文獻記載愛德華氏菌屬（Genus Edwardsiella）中有2菌種常造成水生動物嚴重病症感染。其菌種之一，愛德華氏菌E. tarda已在世界各地造成多種魚類尤其是吳郭魚、鰻魚、鯉魚與比目魚等典型愛德華氏菌症之危害。之二菌種愛德華氏菌E. ictaluri在美國所造成的鯰魚腸敗血症及其他如越南等亞洲國家的鯰魚、淡水魚均已被證實為最重要的傳染病病原菌之ㄧ。有鑑於此，研發有效對抗愛德華氏菌症及鯰魚腸敗血症疫苗是有其迫切必要性。近年來研究指出某些細菌的外膜蛋白如3-甘油醛磷酸脫氫酶 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）可成為魚類抵抗愛德華氏菌及弧菌之有效疫苗的候選蛋白。然而愛德華氏菌E. ictaluri來源的外膜蛋白GAPDH作為疫苗候選蛋白之疫苗效力未被研究。因此本研究即利用大腸桿菌表現系統進行愛德華氏菌E. ictaluri來源的 37 kDa GAPDH之表現，並以鎳離子螯合親和層析法純化此重組融合候選蛋白。根據胺基酸及核苷酸序列的比對分析資料庫中OT9606Z005S株（愛德華氏菌E. ictaluri）來源的 37 kDa GAPDH與其他革蘭氏陰性菌及愛德華氏菌E. ictaluri、E. tarda有高達74–100%的相似度，且以西方墨點轉漬進行候選蛋白的免疫原性分析，結果發現兔抗候選蛋白血清與候選重組蛋白GAPDH有很強的反應。另以此候選重組蛋白（30μg fish-1）混以佐劑ISA 763A、福馬林不活化愛德華氏菌E. ictaluri全菌細胞及生理食鹽水作為陰性對照進行吳郭魚活體對愛德華氏菌E. ictaluri死菌菌苗與候選重組蛋白，包括相對存活百分比 RPS 及其增強魚類抗體等相關性免疫反應效力評估。實驗魚隻在免疫後第四及十二週，分別進行血清凝集、溶菌酶活性及特異性抗體測定。結果在免疫後第四及十二週所有免疫組血清凝集力價均有顯著增加，其值在log2 值2.3 到 11.5之間，而免疫混合候選重組蛋白GAPDH組在免疫後第四週及十二週之特異性抗體力價log2 值顯著高於其他免疫對照組。另一方面，免疫候選重組蛋白GAPDH與福馬林不活化全菌細胞混合組在第十二週時以愛德華氏菌E. tarda攻毒來評估其疫苗之保護效力結果，其相對存活百分達71.4%。綜合以上實驗結果顯示愛德華氏菌E. ictaluri來源的候選重組蛋白GAPDH確實可有效保護實驗吳郭魚不受愛德華氏菌E. tarda的感染。因此未來愛德華氏菌E. ictaluri來源的候選重組蛋白GAPDH將可於愛德華氏菌E. ictaluri、E. tarda之多價疫苗研發時之首選標的物。 鍵詞：疫苗、3-甘油醛磷酸脫氫酶、鯰魚腸敗血症、愛德華氏菌症、外膜蛋白 【Abstract】 Genus Edwardsiella had a two species that have often been reported as causative agents of serious infection in aquatic animal. Edwardsiella tarda, causal agent of classical edwardsiellosis in several kinds of fish, especially tilapia, eel, carp and flounder in the world. Besides, E. ictaluri is known to be the causative agent of enteric septicemia of catfish ESC in the United States of American USA and has been isolated from other freshwater fish in Vietnam and other Asian countries. For these