农杆菌介导的粳稻基因转化.doc

农杆菌介导的水稻基因转化 一．种子消毒和诱导 1）成熟胚去壳，70%乙醇泡1min，0.15%升汞消毒20min，无菌水洗3~4次；接入诱导培养基Oc，26℃暗培养诱导愈伤组织。 二．继代 2）诱导培养35d后，取活力强、颗粒状愈伤转入Oc继代培养。 （每片段需要8瓶） 3）取继代培养20d的愈伤颗粒，接入Ol预培养培养基，26℃暗培养4d。（粳稻可省） 三．浸染 4）在预培养的第三天，用LA（LB＋1.5％琼脂）划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2d。之后，将农杆菌全部刮入Y液体培养基（悬浮培养基）；28℃，200r/m振荡培养0.5-1h。分光光度计600nm波长光测定菌液浓度，调至1.0OD。 （预培养仅籼稻用） 5）将预培养后的愈伤组织接入100ml锥形瓶（大概到40ml处），加入调制好的农杆菌菌液，浸泡30min，期间摇动数次。悬浮培养基:（500ulAS+5ml50%葡萄糖）/250ml悬浮培养基 6）倒去菌液，将愈伤置于灭菌滤纸上吸干表面菌液（先于装有灭菌滤纸的小皿上倒置十分钟以上，然后转铺至大皿大概两小时，一定要吸干（发白），但不能直接吹干，中间翻动几次），接入共培养培养基Oy，暗培养3d。 （准备大皿，小皿，滤纸，吸水纸（圆形））共培养培养基：（250ulAS+5ml50%葡萄糖）/250ml共培养基 四．筛选 7）将共培养后的愈伤用无菌水先快速摇动清洗两次，然后加入无菌水浸泡10min使愈伤内部的菌体游离出来（尽可能用完两瓶水，大概要水洗4-6次）；倒去洗液，再加入含400mg/L 可以多加一点 Cn的无菌水浸泡15min，可重复一次；倒干洗液，将愈伤置于灭菌滤纸上吸干（同浸染6），接入筛选培养基Os；26℃暗培养。每3周继代一次，可达两次。（每片段需灭菌单蒸水1-2瓶，筛选培养基： Hn500ulCn+300ulHn/300ml筛选培养基（400mg/L Cn+250mg/L）） 五．分化 8）将筛选培养基的抗性愈伤组织接入预分化培养基Od1，26℃暗培养一周。 （粳稻可省） 9）将预分化培养一周的抗性愈伤转入分化培养基（50ml/瓶）Od2（改用三角瓶或平底试管）；25℃，2000Lux光照培养，再生转基因植株。 六．生根 10）待小植株3~5cm；转入Or生根培养基上发根。 七．田间种植 11）将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡3~5d；然后移到自然条件下生长，直至成熟。 农杆菌工程菌液的制备 1）菌株活化：在做共培养的前四天，将保存在-70℃的工程菌接种在不含筛选抗生素液体培养基，28℃振荡培养至液体变浑浊；取少量菌液用无菌水充分稀释，取5 l涂于筛选抗生素的LB培养基平皿，28℃培养2d。 2）菌体繁殖：取活化的单菌落接种于不含抗生素的LB培养基平皿，28℃培养2d。 3）菌液配制：把平皿中菌体刮入侵染悬浮培养基（一般采用低无机盐、加有氨基酸的培养基）；28℃，200rpm振荡培养2-3h。取出部分悬浮菌液，分光光度计测定其浓度；然后用悬浮培养基调至需要的浓度。 注意事项： 每次实验前要准备两个灭菌锅，一个用来灭枪头、玻璃器皿、大小皿以及水30min，另外一个用来灭培养基以及50%葡萄糖15min！ （培养基包括悬浮培养基60ml/片段，共培养基250ml/片段，筛选培养基300ml/片段，50%葡萄糖12ml/片段，每片段需小皿1+10+15，大皿2个/片段，小瓶子1个/片段，100ml三角瓶2个/片段，水2瓶/片段，1ml 枪头一盒，以上用品可多准备，以备不时之需） 划线用的平皿以及组配用的都要是刚灭的！ 所有的玻璃器皿一定要灭好（包括划线用的平皿）！灭15min两次或者30min一次！平皿要包两层，一头不要包的太紧，灭完后检查是否有破，否则重新灭！ 培养基也要灭好，灭15min一次！ 瓶子上的封口膜要用两层！ 封平皿的封口膜要足够宽。 所有从超净台外部拿进超净台的物品均要用酒精喷，并且吹15min以上（包括酒精灯，以及划线的平皿）！ 实验前整个房间最好用紫外灯杀30min以上！ 镊子要烧的彻底！ 总之磨刀不误砍柴功！