布氏杆菌菌免疫磁珠检验标准方法汇总.doc

`前 言 本标准适用于食品中布鲁氏杆菌的检验和鉴定。 本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。 本标准由连云港市产品质量监督检验中心提出。 本标准由连云港市产品质量监督检验中心负责起草。 本标准主要起草人： 本标准于2016年5月首次发布。食品中布鲁氏杆菌免疫磁珠富集增菌检验方法 范围 本标准规定了食品中布鲁氏杆菌的免疫磁珠富集检验。 本标准适用于牛羊肉和乳制品检测。 本标准检出限为 20CFU/g 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 20001.4-2001 标准编写规定 实验原理 利用免疫学原理，采用布鲁氏杆菌抗血清交联包被在磁珠表面制备成免疫磁珠，当免疫磁珠遇到菌体抗原产生结合，抗原抗体结合完成后再施加外来磁场，使得免疫磁珠贴与试管壁不被洗脱。然后将磁场消除，磁珠自然落入试管底部，采用非金属接种环或采用加样器将结合菌体的免疫磁珠接种到选择性增菌液中增菌或划线与选择性平板分离培养。 3　设备与材料3.1? 低温冷冻高速离心机。3.2? 电动试管振荡器。3.3　恒温水浴箱。3.4　3.5　3.6 拍打式均质器3.7 ?冰箱 3.8? 全支消毒自动加液器（带滤头） 3.9　　试剂及培养基4.1? Dynabeads M-280 磁珠（日本DYNAL社产）或其他牌号的磁珠 4.2? 牛布鲁氏杆菌抗血清 4.3 羊布鲁氏杆菌抗血清 4.4 羊抗兔Ig (G)4.5 布鲁氏杆菌选择性琼脂 见附录A 4.6 布鲁氏杆菌增菌液EDC solution 液：500mg EDC in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min 4.8 NHS solution 液：250mg NHS in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min 注：EDC 与 NHS 必须现用现配保存液硼酸缓冲体系，0.005M硼酸，pH9.0，0.05w/w %Tween20，0.02w/v%NaN3，0.1w/v%BSABST溶液：硼酸缓冲体系，0.005M硼酸，0.05 w/w%Tween20 MEST洗液：10mM MES，pH5.0，0.05 w/w% Tween 20 5免疫磁珠的交联制备： 5.1 将mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中 2 向管中加入uL MEST（10mM MES，pH5.0，0.05 w/w%Tween 20）对磁粒子进行洗涤3次（结合磁分离操作） 5.3 加入EDC与NHS各2.5mg，调整最后反应体积为500uL，旋转器上旋转，37℃恒温，0.5小时 5.4 活化后，用上述的MEST洗涤除去未反应的活化剂，再换管（去除管壁上可能吸附的活化剂），再洗涤2遍。 5 再用BST洗涤两遍后，再分散到BST中。 6 向每管中加入抗血清300 uL，调整最后反应体积为500uL，进行偶联，4℃，20小时 5.7 用BST洗涤四次（第一次需换管，一定要洗涤干净，每次洗涤时要将磁珠重悬吹散） 5.8 500μL保存液重悬偶联好抗体的磁珠。 　样品制备?.1　 冷冻样品应在45以下不超过15min或在2～5不超过18?h解冻。若不能及时检验,?应放于—15左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于6～10冰箱保存,在24?h内检验。.2　 取样:以无菌操作进行。?.2.1?肝脏:取不同部位。.2.2去脂肪肌肉:剔除脂肪和结缔组织的肌肉。.2.3乳汁:直接挤取的鲜乳汁。.3　以无菌操作称取50?g检样放于均质,以灭菌剪刀充分剪碎。5.4　加mL,拍打均质1min,如无均质器,则应以剪刀尽量剪碎,并充分振荡。? 6.5　。用磁场架固定磁珠用磁场架固定磁珠用洗液清洗悬浮磁珠3次　增菌培养和分离?.1　,于37℃进行选择性增菌培养.2?将免疫磁珠备检液用非金属接种环划线与选择性培养基或等效的选择性培养基上37℃培养。