07 菌种保存法.docVIP

食藥用菇類菌種保存法 前　　言 　　菇類菌種是農業上重要的生產菌，世界各菌種中心莫不把菇類菌種列為保存的重點之一，如美國菌種保存中心(ATCC)、英國國家微生物研究中心(CMI)、荷蘭真菌保存中心(CBS)、日本大阪醱酵研究所(IFO)、美國農部北區研究中心(NRRL)等皆保存有相當數量的菇類菌種。在農業、製藥及發酵工業上，環保菌株、生產菌株、接種源及分析用菌種之保存，均是非常重要的事，尤其是可信賴的優良母株，對於微生物利用工業而言，是絕對必要的，故保存微生物的方法很早就受到相當的重視(Martin, 1964)。不管是農業、醫學、工業、食品等所使用的微生物，不僅要鑑定完善，而且必須在接種過程中，維持菌株特性之安定，如以慣用之定期繼代接種方法，在保存和製造種源時，其遺傳上的安定性較難控制(Lincoln, 1960)，所以必須有一種穩定的保存方法，才能確保優良菌種的遺傳特性。 　　由於菇類菌種的細胞核分裂速度快，且易受環境改變的影響，自然突變的機率大，若未能適當保存，常會發生退化及變異現象而失去其原有之優良特性而降低其生產量及品質，造成栽培者重大損失及食品市場來源不穩定之困擾。民間常用的礦物油保存雖可短時間保存菌種，具有防止污染及避免乾燥之優點，然其穩定性差，一旦寶貴的菌種發生突變或死亡，所造成的損失將無可彌補，所以必須有一套完善的保存制度方是長久之計，任何先進國家成立菌種保存中心之理由亦是在此。因之，如何保存其遺傳之穩定性實為重要之課題。 　　導致基因重組和突變的有絲分裂，與細胞的分裂及代謝活力有關，一個理想的基因種原保存是應在代謝被不活化的狀態下，將活的菌體控制維持其活性，亦即製止其細胞的分裂與停滯其生長 (Jong and Davis, 1987)，此一目標已用超低溫保存方法發展成功，並為長期保存食用菌類的最好方法 (Jong, 1978 1987)。在諸多的冷凍劑中，如液態空氣、氫、氦及氮中，以液態氮被認為是最安全及最符經濟效益的 (Jong, 1987)，然在超低溫凍化過程中，由於水分的傳送均經過細胞膜，冷凍時細胞內冰晶的形成刺傷胞膜與胞內溶質濃度增高，容易導致凍害。控制適度降溫速率可提高細胞存活率，為能降低在凍結及解凍時所發生的冰晶傷害程度，採用適當的化學保護劑，可以減少冰晶的形成。目前已有很多的化學化合物曾被單獨或混合使用為冷凍保存菌種的抗凍劑，這些抗凍劑能控制冰晶的大小及形成速率，能緩和溶質的濃度的急速增高及增加細胞膜的水滲透性，並降低細胞內容物的凝結點，以利冷凍時細胞脫水的進行。抗凍劑有兩大類型，一為浸入型，如甘油及DMSO等，此等溶液能滲入細胞內，而得以胞內及胞外同時發揮其保護效果；二為非浸入型，如糖類及PVP等，用於使胞內胞內於冷凍時與水分子產生結構上的改變與細胞內溶質濃度的平衡，避免脫水過度。 　　冷凍乾燥法是優良的菌種保存方法，能夠維持菌種的穩定性，通常適用於細菌、酵母菌及能產生孢子的黴菌，但對於只有菌而不會產孢的黴菌及菇類真菌而言是不能適用的，因此凍乾法對於菇類真菌來講是有限制的。由於精液及血液能成功地保存於液態氮中，啟發了真菌或許也能利用此一方法來保存的構想。由於此種超低溫保存法能減少細胞內外的液態水而使許多生理作用不能進行，並能防止細胞核的分裂，使細胞發生變異之可能性降低最低，故對菌種中心及相關研究是最重要的方法。 　　菇類之研究領域現已逐漸成為世界各國研究發展為高經濟科技及學術探討之對象，故無論在採集、鑑定、分離、複核、栽培、形態、生理生化分類及長期保存菌種上皆具重要性。菇類在分類上是屬於擔子菌及子囊菌之高等真菌，在農業、醫學、工業等研究範疇中具有相當重要的地位及研究潛力，但是若無法妥善保存菌種，則將導致菌體的變異或退化，使其失去其原有優異的遺傳特性，或降低活性甚至死亡，均將嚴重影響其經濟效益及研究價值，故知長時間保存菌種時應採取適當之措施以防止變異發生。因此，菌種保存工作在科學發展領域上扮演著舉足輕重的角色。菇類自古與中國人之食性有密切之關係，例如香菇、洋菇、草菇、木耳等至今仍為我國甚至於全世界各國人民所喜愛的食品。就保存與銷售方面而言，菇類因屬真菌，在培養基上採菌絲培養是最直接簡便之方法，不過因菌體在培養基上極少產生孢子，不適用於冷凍乾燥法長期保存菌種。若是收集子實體之擔孢子或子囊孢子，雖可利用冷凍乾燥法保存，然因子實體產生之孢子在採收時已曝露在空氣中，尤以野生採集為然，極易受到污染，故在活化接種時必須採用單孢分離，而且必須正負兩個品系交配，所以雖然能確保長久保存的成功率，但因操作繁瑣，只有少數學者研究某特定之屬，且為了雜交育種之便才被採用，以菌種保存中心而言，此法難以被採用。 　　理想之基因種源保存是制止細胞分裂及停滯其生長使其生理代謝完全停止活動。由於食用