20151226 细菌病害分子鉴定试验设计.docVIP

细菌病害分子鉴定实验设计 作者：hefuxin 创建日期：座机电话号码 作者声明：内容涵盖植物细菌病害分子鉴定中16S的克隆、连接载体测序、PCR产物直接测序的一些基本方法，本内容均有本人亲自试验过，为可靠试验方法。 实验材料 通过组织分离得到的的细菌菌株，16s PCR引物，PCR体系，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，胶回收试剂盒，pGEM-Teasy载体与T4连接酶，大肠杆菌感受态，无抗液体LB，加Amp固体平板，蓝白斑筛选试剂，液体加AmpLB，37℃培养箱和摇床。 16S PCR扩增 引物： Primer名称 序列 5to3 fD1 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG rP1 ACGGTTACCTTGTTACGACTT 反应体系：Buffer 5ul，dNTP 4 ul，Taq 1ul，F/R各1ul，ddH2O 38ul。挑取菌落作为模板。 反应条件：退火温度为56，延伸时间为2 min 常规胶回收，连T转化大肠杆菌挑单克隆送测序 电泳胶回收参照试剂盒说明 连接载体 反应体系：Buffer 5ul，pGEM-Teasy 1ul，PCR product 3ul，T4-DNA ligase 1ul，共10 ul。反应条件：22℃ 1 h或者4℃过夜。 转化 将连接产物加入感受态中，冰浴30 min，42℃热激90s，冰浴3min，加入无抗LB，160rpm 37℃震荡复苏1 h，吸取150 uL涂板；在加入Amp 50 ug/ml 的固体LB培养基上，加入40 ul X-gal和4ul IPTG涂板。 X-gal溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）配成20mg/mL原液，IPTG溶于水配成0.2g/mL，于-20℃保存。 摇菌送测序 挑取白斑每个挑取3个，双向测序。或者先进行菌落PCR检测再送测序。 测序选用引物 M13R +48 ：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG M13F -47 ：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC PCR检测可以选用通用引物或者特异引物 M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT M13R:CAGGAAACAGCTATGACC SP6 ATTTAGGTGACACTATAG T7 TAATACGACTCACTATAGG 16S PCR产物直接送测序-引物设计 下载多个细菌门的细菌的16S序列，进行多重序列比对，查找保守序列（表1），用于设计测序引物。选用扩增16S完整序列的fD1（或称为27F）和rP1（或称为1492R）作为第一对测序引物，选用自己设计的16F与16R作为第2对测序引物（表2）。 表1 16S保守区段如下 序列位置 保守序列5-3 55-74 GCC/TTAAC/TACATGCAAGTCGA 387-411 CCAG/A/TGACT/ACCTACGGGA/TGGCAGCAGT 573-594 GTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC 851-872 GGATTAGATACCCT/C/A/G G/A/TGTAGTCC 990-1057 AATTGACGGGGG/ACCCGCACAAGCGGT/A/CGGAGC/TATGTGGT/A/CTTAATTCGATGCAACGCGAA/GGAACCTTACC 1171-1197 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC 1485-1504 CTTGTACACACCGCCCGTCA 表2 最后确定测序引物 客户编号 序列信息 碱基 fD1 5-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3 20 rP1 5-ACggTTACCTTgTTACgACTTT-3 22 16F 5-CAgCAgCCgCggTAATA-3 17 16R 5-TgACgggCggTgTgTACAAg-3 20