胶体金(纳米金GoldNanoparticles)的制备步骤和注意事项.docVIP

胶体金（纳米金Gold Nanoparticles）的详细制备步骤和注意事项 胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。 　　１、玻璃容器的清洁：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。 　　２、试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其１％水溶液在４℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。 　　金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸磷酸盐 pH3～5.8 、Tris-HCL pH5.8～8.3 和硼酸氢氧化钠 pH8.5～10.3 等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。 　　３、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶： 　　取0.01％氯金酸水溶液100ml 加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液 0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在２分钟内变为紫红色，继续煮沸１５分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535 1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。 　　金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表。 附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响 １％柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙 吸收峰 nm 220 240 535 525 522 518 径粒 nm 147 97.5 71.5 41 24.5 15 　　４、柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方法如下：取 4ml１％柠檬酸三钠 Na3C6H5O7.2H2O ，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2（体积与鞣酸加入量相等），以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60℃取1ml１％的 HAuCl4，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至60℃，然后迅速将上述柠檬酸－鞣酸溶液加入，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色 约需0.5～1小时 后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾５分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒大小不同。 　　５、白磷还原法：在120ml双蒸馏水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸 直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。 　　要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数（ＣＶ）可小于１５％。 免疫胶体金制备 　　１、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 　　一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 　　２、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml 含蛋白质5～40ug 加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，５分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置２小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。 　　３、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 　　下述标记步骤最为常见： 　　①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH 标记ＳＰＡ时调到pH6.0 。 　　②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为２～３ml），搅拌２～３分钟。 　　③加入5ml１％PEG20000溶液。 　　④于10000～100000