DNA重组技术的基本工具技术总结.ppt

DNA连接酶 DNA聚合酶 连接DNA链 连接部位 相同点 双链 单链 在两DNA片段之间形 成磷酸二酯键 将单个核苷酸加 到已存在的核酸 片段的3’末端的 羟基上，形成磷 酸二酯键 都能形成磷酸二酯键 二者都由蛋白质构成 * 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 三、基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车” * 载体的必要条件 能自我复制 或能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达 有一个或多个切割位点 具有标记基因 以便重组后进行筛选 对受体细胞无害 结构简单 以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作 * 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。 * 常用的分子运输车有哪些？ 质粒、 λ噬菌体衍生物、 动植物病毒 * * 小结 基因工程 的工具 限制酶 主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键 DNA连 接酶 连接磷酸二酯键 种类 E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶 载体 具备的 条件 自我复制 具一个多个限制酶切位点 具标记基因 大小适中 质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒 对受体细胞无害 * * 专题1 基因工程 * 基础理论和技术的发展催生了基因工程 20世纪中叶，基础理论取得了重大突破 1.DNA是遗传物质的证明 2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立 3.遗传密码的破译 * 技术发明使基因工程的实施成为可能 1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现 3.DNA合成和测序技术的发明 4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功 6.第一例转基因动物问世 7.PCR技术的发明 * 基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。 * 基因工程培育抗虫棉的简要过程： 普通棉花(无抗虫特性) 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 棉花细胞(含抗虫基因) 棉花植株(有抗虫特性) 重组DNA 导入 形成 * 1.1 DNA重组技术的基本工具 * 基因工程需要哪些基本工具? * 培育抗虫棉需要哪些工具？ 分子手术刀—限制性核酸内切酶 分子缝合针—DNA连接酶 分子运输车—载体 * 一、分子手术刀------限制性核酸内切酶(限制酶） * DNA分子上的一段脱氧核苷酸链 * T 磷酸二酯键 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A * * 内切酶切割DNA后形成的末端——黏性末端、平末端是如何形成的？ * 什么叫黏性末端？ * * 什么叫平末端？ * 大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。 SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端 。 * 当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。 * 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 * * 识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 主要是从原核生物中分离纯化出来的酶。 4000种。 1、来源： 2、种类： 3、作用： 4、结果： 形成两种末端 一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶 黏性末端 平末端 * 寻根问底:限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ * 怎样理解限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有? * 为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？ 1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列； 2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。 * 1.原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 2.迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA