植物透射电镜样品制备概要.pptVIP

植物透射电镜样品制备 技术探讨 徐柏森 杨静 南京林业大学电镜室 近年来，随着林业经济的不断发展，研究植物资源的内容也越来越深入，利用透射电镜掌握大量的植物细胞信息，已经成为科学工作者保护森林资源和人类生态环境的重要理论依据。但因植物材料坚硬，难以制备出高分辨的透射电镜样品，从而限制了透射电镜在植物研究中的应用，同时也影响了人类对植物资源的开发和利用。为此，电镜样品的制备技术一直是电镜工作者深入研究的重要内容。 超薄切片的分辨率高，信息丰富，是透射电镜样品制备方法中最优秀、最常用、最基本的常规技术，从取材到染色有二十几个步骤，任何环节出现问题都会影响到样品制备质量甚至导致样品制备失败。加之，植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢，其制备难度就显得更大一些。 我们经过多次试验，发现采用延长锇酸固定时间和减少树脂渗透浓度的方法可提高植物透射电镜样品的制备成功率和制备质量，使植物的花粉、径、叶、根等细胞结构显示得更加清晰，整体信息提供的更加丰富。经过200多个植物透射电镜样品的观察，不但能准确观察到植物的超微结构形态，还缩短了植物透射电镜样品的制备周期。本课件以杂种鹅掌楸、拟南芥和毛竹三种典型的植物材料为例。 1 材料 1.1 杂种鹅掌楸花粉，南京林业大学校园内 随机取样，浸入3%的戊二醛固定。 1.2 拟南芥，南京农业大学提供，采摘后即时浸入3%的戊二醛固定。 1.3 毛竹，江苏大学提供，取样后即时浸入3%的戊二醛固定。 2 方法 样品在3%的戊二醛中，固定2小时以上，然后0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2次，每次10分钟，锇酸固定5小时后，0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2次，每次10分钟，丙酮梯度脱水，纯丙酮脱水2次，812树脂按3：1；3：2；3：3梯度渗透，之后打开样品瓶盖，放置干燥处8小时，再包埋，梯度聚合，切片，染色，透射电子显微镜观察。 3.1杂种鹅掌楸花粉 细胞壁厚，组织坚硬，药物难以渗透，是典型的制备难度大的透射电镜样品。采用常规制备方法，超薄切片常会出现花粉内部结构不清晰、切片有颠痕、污染等不良现象，甚至无法观察到样品的超微结构，造成前功尽弃，只能从头再来，进一步延长了工作周期。笔者采用延长锇酸固定时间，减少树脂渗透浓度的新方法制备出了50多个杂种鹅掌楸花粉样品，整体信息丰富，结构保存良好，没有出现不良现象。 图4为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面，可见片面平整、无污染、整体结构保存良好。图5、图6为叶绿体的全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富，结构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。 图8和图9为毛竹经过不同工艺处理后的细胞结构比较。图8为经过加热处理后的细胞结构状态，可见细胞形态变化较大，呈扭曲状，但无断裂和损坏现象，内部物质尚能得到保存。切片完整，无颤痕和污染现象。图9为联合处理后的细胞结构状态，图中显示的内部细胞结构变化较小，细胞壁基本处于完好状态，个别细胞壁间出现断裂现象，细胞内部物质保存良好，可见此工艺对毛竹的整体损伤较小。 4.1 一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定，时间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，性能区别较大，在后固定时需区别对待，对于迅速发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时，否则，会造成样品发脆，难以操作，甚至破坏掉已保存的结构。 4.2 在812树脂渗透的过程中，采用3：1；3：2；3：3梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。根据植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢的特点，梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上，否则，影响渗透效果。 * * 研究背景 研究背景 3 结果 图1为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌，可见花粉内部细胞器结构保存良好，细胞壁结构保存完整，边缘信息丰富，在许多花粉中都可见到尾状突起。 图2为败育的杂种鹅掌楸花粉全貌，可见花粉内部的质体减少，线粒体变异，细胞器呈退化状态，边缘的细胞壁组织也出现了明显的变异和加厚现象，使药物更难渗透，对于此类样品若采用常规方法制备，则结构模糊，信息量较少，往往只能看到少量的片层结构。采用改进方法对其进行制备时，由于固定彻底、渗透均匀，不但可以很好的保存组织结构，还可以提供丰富的信息资料。 图3所示的多层结构即为药室内壁的胼胝质加厚现象。可见新方法制备的样品能够提高植物样品的分辨率，使超薄切片显示出更多的微细结构。 拟南芥是液泡组织较大的植物，在溶液中叶片难以下沉，是较难固定的植物透射电镜样品。加之，细胞壁结构坚硬，药物难以渗透，其样品制备更加困难。若采用常规制备方法，则会出现叶片内部结构不清晰、切