6.基因分析N概要.ppt

* 实验流程： 1）抗原蛋白的制备： 一般用细胞或组织制备的裂解物。裂解物的制备首选用温和的去污剂如非离子去污剂来裂解细胞。保证不破坏蛋白与蛋白之间的互作。 2）裂解物非特异性本底的预处理：一般在制备的细胞裂解物种加入非特定的抗体IgG，预先去除可能与抗体蛋白结合的组分。 3）免疫复合物的形成与纯化：加入特定抗体和固定化的蛋白A,历次年沉淀分离能够与特定抗体结合的蛋白复合体。 4）鉴定：SDS分离复合体，用特定抗体进行western-blotting 检测。或将获得的蛋白条带切胶，用质谱鉴定（未知蛋白）。 * * 1. 人类基因组计划(HGP) 三. 基因组水平的分析 1990年美国科学家提出了人类基因组计划(HGP). 目标就是在2005年完成测定人类基因组全部的30亿对核苷酸,完全由政府投资30亿美元.后来,先后有英国,德国,日本,法国,俄罗斯和中国参加(3号染色体，3000kb). 该计划的实施同时也促进了了几种模式生物,如大肠杆菌,酿酒酵母,拟南芥等的基因组测序. 在技术上,HGP计划还促进了DNA测序策略和技术的飞速发展; 同时带动了整个生命科学及其研究技术的发展. * mRNA差异显示 首次由(Liang, P等 1992)发展起来的在基因组水平分析不同样品中基因表达差异的一个方法, 其基本原理是以mRNA为模板,首先利用一组3’-端锚定引物(如GCTTTTTT…, AGTTTTT….’, TGTTTTTT…, CGTTTTTT…)进行RT,反转录为cDNA;第二次用一组5’-端Arbitrary引物(随机核苷酸,序列已知)进行单链PCR扩增; 然后在测序胶上将这些DNA片段分开,就可以显示不同样品mRNA表达差异.最后将差异的DNA带回收,再次PCR扩增,测序; 从而发现不同样品中,表达差异的基因. 该方法简单,直观,不需要特别的仪器; 并且可以同时比较2个或者以上样品的基因表达差异.但是,对于低丰度表达的基因敏感较差,可能漏掉一些基因, 因此在第二链扩增时,通常进行同位素等标记. 2. 转录组分析 * mRNA差异显示 * 2) 基因芯片分析 基因芯片(chip/microarray)是基于核酸杂交发展起来的一种大规模分析基因表达的技术平台, 大概分为两种类型:一是由Affymetrix公司发展的直接在石英表面原位化学合成的寡核苷酸单链DNA,构成的微列阵. 在1.28 cm2的表面可以合成多达500,000个寡核苷酸单链. 另一种类型由Stanford Univ. Patrick Brown发展的,利用机器人点样仪将PCR放大的dsDNA片段点制在载玻片表面, 然后经过固定变性, 制备得到DNA芯片. 分析过程: mRNA sample 1 ? cDNA ? Lebeled with fluor(Cy3, green) mRNA sample 2 ? cDNA ? Lebeled with fluor(Cy5, red) Hybridization to the chip ?Analysis(comparing differences between the two samples) * 基因芯片技术 * 3) 基于RNA测序的转录组分析 利用DNA测序技术，对特定细胞所有的RNA进行测序，最后获得全细胞基因组转录RNA的全景，了解特定细胞或比较不同细胞基因组表达的差异，寻找差异表达基因。 早期发展的基于大规模测序的SAGE等分析方法，近来基于二代测序技术使转录组分析获得了极大的进展。 * RNA-seq技术流程 * 4) 染色质免疫沉淀(ChIP) 基因转录依赖于转录因子或转录调控蛋白与特定基因启动子序列的结合. ChIP技术主要用于鉴定转录因子在基因组中的靶序列或者分析转录因子作用的顺式元件. 前提条件是带分析的转录因子是已知, 并且有相应的抗体. * 3. 蛋白组分析 蛋白质组（Proteome）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学(proteomics)本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。 蛋白质双向电泳将细胞蛋白质分开。常常用于比较两个样品之间的差异. * 依据蛋白质等电点和大小将蛋白质分开, 一块胶可以分出几百个点(或蛋白质). 1）双向电泳 第一步: 等点聚焦电泳； 第二步