慢病毒载体介导livin基因沉默对人肺腺癌裸鼠移植瘤生长及凋亡影响.docVIP

福建医科大学 2011 届硕士研究生毕业论文 RNA 干扰沉默 Livin 基因对人肺腺癌细胞株裸鼠移植 瘤生长及凋亡的影响 中文摘要  背  景：  肺癌是人类癌症死亡的主要原因之一。其中，非小细胞肺癌(non—small cell lung cancer，NSCLC)最为常见，占肺癌的 75～80%。Livin 基因是凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成员，本课题组的前期实验证实慢病毒载 体介导的 LivinSiRNA 在体外可以有效地促进 SPC-A-1 细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞 的增长。本课题在此基础上构建人肺腺癌裸鼠移植瘤模型并将慢病毒携带的 livin shRNA 注射入瘤体内，以观察沉默 livin 的表达对 SPC-A-1 裸鼠移植瘤生长、凋 亡以及细胞周期的影响，进一步观察 livin 是否可成为肺癌基因治疗的靶点，及体 内注射慢病毒 shRNA 的治疗效果。  目  的： 利用慢病毒携带的 livin shRNA 注射肺腺癌裸鼠移植瘤，干扰 livin 基因表 达，观察其对肺腺癌裸鼠移植瘤生长及细胞凋亡、周期、增殖的影响。  方  法：  将 SPC-A-1 细胞接种至 BALB/C 裸鼠右腋皮下，建立 SPC-A-1 裸鼠皮下移 植瘤模型，接种后第 8 天（移植瘤长至 100mm3 左右），按瘤体大小随机分成三 组：空白对照组、阴性载体对照组、治疗组。分组后连续四天对三组裸鼠给予不 同干预治疗组：瘤内注射 livin shRNA 慢病毒颗粒（2×106TU，5ul）；阴性 载体对照组：瘤内注射携带无关序列的慢病毒颗粒（2×106TU，5ul）；空白对 照组：瘤内注射生理盐水（5ul）。观察裸鼠的一般情况、移植瘤生长情况，测量 瘤体体积、瘤体重量，并绘制肿瘤生长曲线、计算抑瘤率、western-blot 方法检测 各组 livin 表达。原位末端转移酶标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL）、流式细胞仪 Annexin V-FITC/PI 双染检测移植瘤组织凋亡情况，PI 单染 法检测移植瘤细胞周期分布情况。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 比色法（ 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ，MTT） 检测细胞增殖能力。 4 福建医科大学 2011 届硕士研究生毕业论文  结  果：  1、livin shRNA 慢病毒治疗组 livin 蛋白表达较对照组明显降低，(P0.01，P0.01)， 提示慢病毒注射瘤体后显著干扰其表达。 2、与空白对照组和阴性载体对照组相比，治疗组瘤体生长减缓，移植瘤体积、重 量明显减小(F=254.64，P=0.00)。 3、沉默 livin 基因后细胞凋亡明显增加：凋亡指数：（31.48±3.79）% vs（6.55± 1.30）%； 7.47±1.28）%，F=203.28，P=0.00。凋亡率： 15.47±1.14）% vs（4.42 ±0.76）%；（5.26±1.02）%，F=116.39，P=0.00）。 4、细胞周期检测结果显示，livin shRNA 治疗组移植瘤细胞进入 G0／G1 期的细 胞增多，进入 S 期的细胞减少，SPC-A-1 细胞周期出现 G0／G1 期阻滞。 5、MTT 显示细胞增殖减缓， 72h 细胞增殖抑制率最高，达到（31.15±4.62）%。  结  论：  在SPC-A-1裸鼠移植瘤中瘤内注射慢病毒介导的livin shRNA成功沉默移植瘤 中livin的表达，裸鼠移植瘤细胞周期阻滞，细胞凋亡增加、增殖明显受到抑制， Livin基因可望成为肺癌治疗的新靶点，慢病毒介导的RNA干扰技术可望成为有效 的基因治疗工具。 关键词：Livin 基因；RNA 干扰；移植瘤；SPC-A-1 细胞株 5 福建医科大学 2011 届硕士研究生毕业论文 Effects of silencing livin gene by RNA interference carried by lentiviral vector on tumor growth and apoptosis in nude mice ABSTRACT Background Lung canc