16S rRNA基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌的研究.docVIP

16S rRNA基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌的研究 　　摘要：对66株猪多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明，PCR是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。应用能够扩增大多数原核生物16S rRNA基因的通用引物，对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16S基因rRNA进行PCR扩增，以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。 　　关键词：多杀性巴氏杆菌；16S rRNA；PCR 　　中图分类号：S852.61+2 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）05-0005-02 　　多杀性巴氏杆菌是一种广泛存在的感染致病菌，在我国规模化养殖场常有染病和发病。目前，在兽医临床上对该病的确诊仍普遍采用传统的病原分离方法，即通过对细菌进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴别，以确定细菌的种属和血清型。虽然这种方法能取得可靠的鉴定结果，但存在操作繁琐，耗时长等不足。近年来，唐先春等[1]建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法，对66株多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明，PCR检测是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法对禽多杀性巴氏杆菌的分离株及我国的代表性疫苗株进行了鉴定研究，结果表明2株分离菌与对照的强弱毒株之间的同源性为100%。 　　该试验应用能够扩增大多数原核生物16S rRNA基因的通用引物，对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增，以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 　　UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。Premix-Taq酶和DNA Marker均为TaKaRa公司产品。 　　1.2 仪器 　　电热恒温培养箱、冰箱、无菌操作台、电泳仪及紫外分析仪、PCR仪。 　　1.3 培养基 　　血清肉汤：称取营养琼脂粉末33 g加入1 000 mL蒸馏水，加热溶解后分装高压灭菌（121 ℃，30 min）后，冷却到50～60 ℃，按3%的比例加入新生小牛血清，低温保藏备用。 　　血液琼脂平板：称取营养琼脂粉末33 g加入 1 000 mL蒸馏水，加热溶解后分装，高压灭菌（121 ℃，30 min）后，冷却到50～60 ℃，按5%～6%的比例加入无菌脱脂纤维兔鲜血，然后制成平板低温保藏备用。 　　麦康凯琼脂平板：称取麦康凯琼脂粉末33 g加入1 000 mL蒸馏水，加热至全部溶解，121 ℃高压灭菌30 min后，制成平板，低温保藏备用。 　　1.4 菌株来源 　　猪巴氏杆菌标准疫苗株（EO630），为广东省农科院兽医所提供。 　　猪巴氏杆菌野外分离株，为佛山科学技术学院传染病实验室提供。 　　1.5 基因组DNA的抽提 　　将血液琼脂培养基上的野外分离株用无菌生理盐水制成的细菌洗液和猪巴氏杆菌疫苗株，用UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒抽提细菌基因组DNA。操作步骤如下： 　　（1）取200 μL制备好的样品，加入400 μL Digestion Buffer混匀，再加入3 μL Proteinase K混匀，55 ℃保温5～10 min。 　　（2）加入200 μL无水乙醇混匀，然后用1 mL Tip 头将样品全部转移到套放于2 mL 收集管内的UNIQ-10柱中。 　　（3） 8 000 r/min室温离心1 min。 　　（4） 取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solition，10 000 r/min，室温离心30 s。 　　（5）重复步骤（4）一次。 　　（6）取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，10 000 r/min，室温离心15 s，以除去残留Wash Solution。 　　（7） 将柱放入新的洁净1.5 mL离心管中，在柱中央加入50 μL Elution Buffer，室温放置2 min。 　　（8）10 000 r/min，室温离心1 min。离心管中的液体即为基因组DNA。样品可以4 ℃或～20 ℃保存。 　　1.6 引物 　　使用能够扩增大多数原核生物16S rRNA 基因序列的通用引物，该引物同时能够扩增出猪附红细胞体和猫血巴尔通氏体的16S rRNA基因序列。引物由上海博亚公司合成。引物序列如下： 　　上游引物：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′； 　　下游引物：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′。 　　1.7 PCR扩增 　　PCR反应