体外哺乳动物细染色体畸变试验.docVIP

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。 6.1.3.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或水。二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度不应大于0.5%。 6.1.3.3 受试物浓度设置 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency）、存活细胞计数(viable cell counts)或有丝分裂指数(mitotic index)。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。 剂量设置：①至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范 围应包括从最大毒性至几乎无毒性；通常浓度间隔系数不大于 2 ~。 ②在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计 数或有丝分裂指数（均应大于50%）。 ③对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5μl/mL， 5mg/mL或0.01mol/L。 ④对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性， 则最高剂量应是，当处理期结束时，在最终培养液中溶解度限 值以上的一个浓度。在某些情况下（即仅当高于最低不溶解浓 度时才发生