pcr反應模板的制备.docVIP

PCR反应模板的制备 　　PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量. 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜， 使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定. 1微克人基因组DNA相当于3*10的五次方靶分子， 10纳克酵母DNA相当于3*10的五次方靶分子 1纳克大肠杆菌DNA相当与······ 所以，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入含靶序列的DNA量也不同 如真核核糖体RNA基因有200~500拷贝，反应中仅需加入0.5~2纳克人基因组DNA即可 以质粒DNA或染色体DNA为模板时扩增最适条件不同。前者所需的酶量少，循环数少，温度不如染色体DNA要求严格。 模板核酸的提取制备方法 　　(一)蛋白