噪聲对鲤鱼的影响-----用RIA放射免疫法测定血液的皮质醇含量.docVIP

噪声对鲤鱼的影响 ————用RIA放射免疫疗法测定鲤鱼血液中皮质醇含量 生命科学学院2012级生物科学2班 小组成员：佐合然古丽20120513211 胡睿20120513194 曾悦20120513203 王蕾20120513204 宋鑫娅20120513210 一、研究背景 人为活动噪声能影响鲸、鸟类和鱼类的日常行为、摄食和生态学过程,研究表明,长期暴露于噪声等应激状态下会导致生物体处于一种异平衡负荷,生物体适应异平衡付出的代价是造成能量的消耗,进而造成机体各项机能的下降。噪声轻者可致捕食、种间交流和洄游等能力下降,重者的可屏蔽动物听觉或引起听觉的暂时性失聪。Ｓｖｅｒｄｒｕｐ研究发现,在不考虑鱼类听觉阈值的情况下,噪声能引发鱼类的内分泌学胁迫应答。 脊椎动物通过神经内分泌激素对强烈刺激所作出的反应将导致其生理或行为上的预警反应,皮质醇水平是衡量预警反应的重要生理指标。例如:拥挤和剧烈振荡胁迫造成草鱼血液内皮质醇含量大幅度升高,亚致死量重金属和高密度饲养模式都能提高机体内皮质醇水平,环境温度的变化也影响裸盖鱼(Ａｎｏｐｌｏｐｏｍａｆｉｍｂｒｉａ)皮质醇的反应。Ｌｉｄｉａ研究发现,噪声可以促使3种淡水鱼皮质醇的分泌,欧洲大西洋鲑鱼(Ｓａｌｍｏｎｓａｌａｒ)与鲈鱼(Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓｌａｂｒａｘ)呈现相同的应激答。目前,噪声对生化压力的反应研究主要集中于哺乳动物,而对于海洋鱼类和淡水鱼类对噪声应激的反应研究资料相对匮乏。随近几年淡水生态系统的开发活动的升温,在淡水环境中,船舶噪声会对鱼类产生胁迫且此类问题日益突出,本文在实验条件下就船舶噪声对重庆市长江流域的淡水鱼鲫鱼对船舶噪声的影响的现象研究，以期为淡水生物应激生物学提供科学资料。 （一）研究目标 1、船舶噪声是否会对鲤鱼的内分泌造成影响。 2、鲤鱼对于船舶噪声的影响机体是否有相应的应对措施。 3、人类对于解决船舶噪声对鲤鱼的影响可以采取什么样的方式。 二、研究方法与步骤 （一）实验方法选择 放射免疫法(RIA）。 根据实验分析，本实验采用竞争性RIA，又称传统RIA优点：经济，简便，通用。 （二）实验原理 实验基本原理是当内源性（未标记）的皮质醇和标记的皮质醇在一起孵育时，它们相互竞争抗体 ，把与抗体结合的皮质醇的量和已知的标准量进行比较而定量，即根据被测定的抗原物质和其标记物（标记抗原）同特异性抗体之间存在着竞争性的结合。主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag +已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物AgAb+未知抗原与抗体复合物Ag Ab+游离标记抗原Ag （去除）（未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关）。若以Ag和Ag*分别代表待测抗原和标记抗原，Ab代表抗体，Ag·Ab和Ag*·Ab分别代表非标记的和标记的抗原抗体复合物，则当Ag与Ag*同时存在时，这一系统呈如图所示的平衡关系： 在Ab恒定时，由于Ag的存在而使Ag*·Ab的产量减少。若F代表未结合的Ag*，B代表Ag*·Ab复合物，则B/F与Ag之量存在函数关系。若以B/F为纵坐标，Ag浓度（ng/ml）为横坐标，则可绘制出剂量反应标准曲线。测量未知样品时，只需在同样条件下测量B和F的放射性，即可由标准曲线求出被测样品的浓度，而不需纯化样品。本方法要求有高纯度的标记抗原，测定标准曲线时要寻找合适的标准品，标准品的免疫活性应与待测样品相当，且不含放射性免疫干扰物。 竞争性RIA法，根据加样顺序与温育次数的区别，反应方式分三种：平衡法，顺序加样法，急诊检测法。 此次实验采取顺序加样法，即先将非标记抗原（被测物与标准品），与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后。加入标记抗原，再作第二次温育后，分离B（复合物）与F（游离物）。 （三）、实验步骤 取正常鲤鱼血样 从驯养于水族箱的未受刺激的鲤鱼中，取出3条，直接放入0.1g/LMS-222溶液中。此过程要快，尽量不要惊动水族箱中剩下的鱼，以免它们产生应激反应。当麻醉的鱼鳃盖停止运动时，便可取血样。一手抓住鱼，另一手擦干躯干和尾部的水，用剪刀从尾柄处切断尾部，用含量少量肝素1ml注射器（不要针头）直接从血液流出的地方收集血液（尽量取），放入微量离心管中，立即离心。小心取出血浆，移到另一微量离心管中，贮存于冰箱（4℃）中。 取处于噪声状态的鲤鱼血样 单次刺激和重复刺激噪声源强均为138ｄＢ和155ｄＢ两个水平, 单次刺激为实验初期以噪声源刺激10ｍｉｎ后在每天的规定时间点取样, 重复刺激为每隔24ｈ以固定源强的噪声刺激10ｍｉｎ, 作用停止30ｍｉｎ后取样;梯度噪声刺激源强分别为112ｄＢ(对照组)、138 ｄＢ、144 ｄＢ、146 ｄＢ、151ｄＢ和155ｄＢ等6