實时荧光定量PCR在毒理学中的应用.docVIP

实时荧光定量PCR技术及检测方法 杨德山 摘要：实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为核酸研究中的重要工具。本文就实时荧光定量PCR技术的原理、检测方法进行综述。 关键词：实时荧光定量PCR 原理 检测方法 传统的PCR定量是应用终点扩增产物来对样品中的模板量进行定量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，而且一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量并不准确。此外，终点PCR还容易交叉污染，产生假阳性。 1 实时荧光定量PCR技术的原理 实时荧光定量PCR技术是在传统的PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。在实时荧光定量PCR反应体系中，随着PCR扩增产物的不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化。从而得到一条荧光扩增曲线。PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显区别，之后反应过程中产生的DNA拷贝数是以指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式扩增，从而进入“平台期”。这样荧光扩增曲线就呈现：基线期、扩增期和平台期。在PCR反应处于指数扩增期的时候，PCR产物的对数值与起始模板存在线性关系，这时在扩增期的某一点监测PCR产物的量，由此可以推断出模板起初的含量[2]。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，实时荧光定量PCR中采用参数“Ct”值，Ct值（cycle threshold Value,Ct)即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小[3]。利用已知起始拷贝数的标准品可以绘制出标准曲线：因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上推算出该样品的起始拷贝数[4]。 2 实时荧光定量PCR检测方法 目前，根据实时荧光定量PCR所使用的荧光化学物质不同，荧光定量PCR技术主要可分为两类，即荧光染料类和荧光探针类，其中荧光染料类主要使用的染料分子是SYBR Green Ⅰ；荧光探针类可分为水解探针、分子信标、双探针杂交和复合探针等。 2.1 SYBR Green Ⅰ SYBR Green Ⅰ能与DNA双链的小沟特异性的结合。游离的SYBR Green Ⅰ几乎没有荧光信号，但结合DNA后，它的荧光信号可呈百倍、千倍的增加。因此PCR扩增的产物越多，SYBR Green Ⅰ则结合的越多，荧光信号也就越强[5]，可以对任何目的基因定量。 SYBR Green Ⅰ的优点是使用方便，不需要设计复杂的荧光探针，使检测方法简单，检测成本降低；并且它没有引物的特异性，能够检测任何双链DNA序列的扩增，可用于不同的模板；同时可以使用融解曲线检测扩增反应的特异性。其缺点也正是其能与任何双链DNA结合的特性，使其能与非特异的双链DNA结合（如引物二聚体），使实验容易产生假阳性信号，且SYBR Green Ⅰ对PCR具有一定的抑制性，并且荧光强度较差，稳定性较差。 2.2 水解探针 水解探针是以TapMan探针为代表，也称外切核酸酶探针。TapMan探针是长度约为20-24bp的寡核苷酸，其基本原理是利用Tap酶的5外切酶活性，即Tap酶具有天然的5’-3’核酸外切酶活性，能够裂解双链DNA 5’端的核苷酸，释放出单个寡核苷酸。基于Tap酶的这种特性，依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。当无靶序列存在时，3’端猝灭基团抑制5’端报告基团的荧光发射。当有特异的而不是非特异的PCR发生时，Tap酶同时发挥其 TapMan探针技术的出现解决了荧光染料非特异性的缺点，反应结束后不需要进行寡核苷酸融解曲线分析，缩短了实验时间。但是TapMan探针的价格价高，且对目标序列的特异性很高，只适合一个特定的目标，不便普及应用。此外TapMan探针两侧的报告基团和猝灭基团相距较远，猝灭不彻底，本底较高，而且该方法也容易受Tap DNA聚合酶的5’ 分子信标 分子信标（molecular beacon）技术是一种基于荧光共振能量转移原理建立起来的新型荧光定量技术[7]。分子信标是一段与特定核酸互补的寡核苷酸探针，是TapMan探针的衍生