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高效液相色谱法(HPLC) high performance liquid chromatography 黑龙江省药检所 姜连阁 Jiangliange @ 分离原理 按溶质在两相过程中的物理化学原理分类 分配色谱:—分配系数 亲和色谱:—亲和力 吸附色谱:—吸附力 离子交换色谱:—离子交换能力 凝胶色谱(体积排阻色谱):—分子大小而引起的体积排阻 各种液相色谱法的比较 主要HPLC方法的特性 色谱模式在给定的应用中主要取决于填料的性质，应当注意除主要保留机制之外，还可能有其它辅助的机制存在。 大多采用键合相色谱法，将极性或非极性基团化学键合在硅胶基质上作为固定相。分离是基于化合物在固定相和流动相中的分配。 色谱系统由极性固定相和非极性流动相组成，称为正相色谱法（NPC）。反之，非极性固定相和极性流动相，为反相色谱法（ RPC）。 反相HPLC法是最常用的高效液相色谱法。 主要HPLC方法的特性 分离选择性 保留时间、峰面积重现性 流动相组成； （溶剂、缓冲pH） 固定相组成； （色谱柱\填料粒度\柱长） 温度． 流速 目的：定性、定量 改善色谱分离选择性的方法 1．调节流动相的极性 2．向流动相中加入改性剂 （1）离子抑制法 （2）离子强度调节法 影响离子对色谱分离选择性的因素 1．溶剂极性的影响 2．离子强度的影响 3．pH值的影响 4．温度的影响 5．离子试剂的性质和浓度的影响 (一)溶剂强度的影响 成分的保留可通过改变流动相的溶剂强度加以控制。强溶剂降低保留而弱溶剂增加保留。 改变溶剂强度控制样品保留 峰形不佳对积分准确度的影响 首选的实验条件 色谱柱：C18或C8，粒度：5μm 流动相：水(A)—乙腈或甲醇(B) B%：50~100% 流动相 改变%B（比例） 改变有机溶剂种类（所有）? 使用混合有机溶剂（所有）? 改变pH（离子）? 改变离子对试剂浓度（离子）? 改变缓冲液或缓冲液（离子）? 改变添加剂浓度（离子） ? 流动相 1.反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下: H20甲醇乙睛乙醇丙醇异丙醇四氢吠喃 最常用的流动相组成:“甲醇一H20”和“乙睛一H20”。 2.正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是: 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇 溶剂强度的影响 —强溶剂减少保留，弱溶剂增加保留 甲醇、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异 pH对峰形的影响 反相色谱pH对保留的影响 ?有峰形差的可能性(程度与填料品牌相关)?需要精密控制pH以获得良好的色谱重现性 pH对保留因子的影响 缓冲容量，UV吸收值，溶解度、稳定性、与样品和/或色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等 碱性化合物和金属螯合物的峰形解决方法 在高pH下建立分析方法有诸多好处: ?? 极性有机碱的保留大大增强 ?? ?? 碱性化合物的峰对称性极佳 – 当需要分离复杂混合物的分离时，能在全pH范围摸索分离选择性 对HPLC色谱柱的要求 合适的选择性 良好的色谱峰形 重现性---要求准确的检测结果 – 色谱柱间重现性 – 批次间重现性 宽应用范围 良好的色谱柱寿命 可追溯性与严格质量控制 硅胶反相C18填料选择性差异来源 疏水性不同 – 不同硅胶颗粒基质 密度，表面积，孔径 纯度 低pH可能导致分离度降低或根本不能分离  固定相配基类型发生改变时，分离选择性有显著变化。苯基柱对的保留能力比在C18柱上还要强。一般对含有苯环的物质选择性好 不同基体C18柱间的分离选择性差异 中pH尤其是高pH磷酸盐缓冲盐会腐蚀柱填料颗粒。 ? 在通常的UV检测波长范围内（例254nm)，有许多对填料颗粒腐蚀性很小的高pH缓冲系统可供使用，包括碳酸氢铵、三乙胺、氨水等都可方便地提供pH在9-11之间的良好缓冲能力 ? 在绝对需要使用到pH12的磷酸盐缓冲液的场合，需要注意如下事项： – 柱温务必保持在30oC以下 – 保持柱上缓冲液浓度在5 to 10 mM之间 – 注意当流动相中含有高组份的有机溶剂时，磷酸盐可能会在柱上和仪 器管线内析出。可预先在烧杯内做流动相混合试验观察有无沉淀生成。 – 缓冲液一定要预先过滤 – 使用保护柱可增加分析柱的寿命 、 pH对分离选择性和方法耐用性影响 ? 对于含有有机酸和碱混合物的分离，流动相pH是最强大的分离选择性工具 ? 当分析物间含有相近的pKa值时(例如全为有机酸或碱时),流动相溶剂和色谱固定相成为影响分离选择性的重要因素 ? 流动相pH的选择对方法稳定性、耐用性具有重大影响，因此是方法开发中需要当作重中之重的因素进行关注的方面 – 切记, 要取得最好的色谱保留与峰形: ??