蔗糖酶的分離提纯.docVIP

PAGE PAGE 7 蔗糖酶的分离提纯 【实验目的】 1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。 【实验原理】 蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase系统命名：β--D—Fructofuranosideffructonydrolase。 蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是： CH CH2OH H OH H H OH CH20H O 蔗糖酶 H OH OH H 蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。 我们实验室的研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。 【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂 (1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol／L NaOH；(10)0.5mol／L HCl；(11)0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol／L NaCl的O.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液； (13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 2．仪器 (1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴； (4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表 【实验操作】 一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨酸试剂： N0 含糖量 (mg) O．2％葡萄糖 标准液(mL) 水 (mL) 3,5--二硝基水杨 酸试剂(mL) OD540 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。 2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 二、蔗糖酶的分离提纯 1．蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶 称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入1.5克乙酸钠 (2)提取及粗酶的制备 往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。 量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存） 2．乙醇分级 将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。 (1)32％乙醇饱和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。 X1/（V+X1）=O.32 式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。然后再按X1／0.95换算出使乙醇浓度(按体积)达32％时所需95％乙醇的体积。 把粗酶液和量好体积的95％乙醇在冰盐浴中预冷(0～2℃)。小心缓慢滴加乙醇，同时不断搅拌，一定注意不要使乙醇局部过浓，否则会引起酶变性失活。 在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000r／min离心5min。上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。 (2)47.5％的乙醇饱和度 按下式算出使酶液乙醇浓度达47．5％时所需乙醇的量 X2/(V+X2)=0.475 式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。再按X2／0.95算出需95％乙醇的体积。按下式可算出使乙醇浓度达47．5％时所需补加的95％乙醇体积。 X2/0.95-