第八章_PCR技术及其应用.ppt

平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因： 底物和引物的浓度降低 dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用 非特异性产物或引物的二聚体产生非特异性竞争作用 扩增产物自身复性 高浓度扩增产物变性不彻底 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素： 阈值(threshold)：RT-qPCR扩增开始后，将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度值。 基线：从第3个循环起到Ct值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般以3-15之间。 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。 * * 二、荧光标记方式 1、SYBR Green荧光染料： 它结合到双链DNA的小沟中后发出荧光，非结合状态不发出荧光，最大吸收波长为497nm，最大发射波长为520nm，通用性好，灵敏度高，价格