转基因植物产品检测实室一览.docVIP

转基因植物产品检测实验室一览 序号 仪器名称 用途 参考品牌型号与配置 大大致预算 1 高速冷冻离心机 生物样品的高速分离（冷冻保持样品生活活性）。 德国eppendorf；美国Thermo；德国Sigma；德国Herolab。 50000 120000 2 定性PCR扩增仪 50000 110000 定量CR扩增仪 美国ABI、德国eppendorf、美国Bio-rad。 250000 780000 3 PCR专用工作台 保证PCR时的无污染。（或建设标准的PCR层流实验室） 德国Peqlab。 （国产超净台也可替代。） 10000 34000 4 电泳槽、电泳仪 基因片段扩增之后跑凝胶。 德国Peqlab、美国Bio-rad。或北京六一。 15000 40000 5 凝胶成像系统 对凝胶进行分子量、等定性分析 法国VL，美国Bio-rad、或国产。 350000 150000 6 紫外透射仪 国产 6000 15000 7 制冰机 国产 20000 35000 8 CO2培养箱 美国Tehrmo。美国shellab 20000 50000 9 液氮罐 国产。 4000 10000 10 超纯水 美国millipore；美国Tehrmo。 40000 76000 双蒸馏水发生器 国产 4000 18000 11 分子生物常用耗材与试剂 5000 10000 12 转基因专用试剂 5000 10000 其他设备： 细胞融合仪核酸提取仪-30℃低温冰箱漩涡混合器超声波细胞粉碎仪自动恒温酶标7 操作步骤 7.1 抽样 参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样。 7.2 制样 7.3 DNA模板的制备00-400 mg试样，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5 ml离心管中。 加入1ml预冷至4 ℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13 000 r/min离心机，4 ℃离心15 min，弃去上清液。 加入600 μl 预热到65 ℃的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65 ℃的水浴锅中裂解40 min。 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清液转至另一离心管中，加入5 μl RNase A （10 mg/ml），37 ℃ 水浴30 min。 分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次。 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10 体积3M乙酸钠（pH 5.6），-20 ℃ 放置2-3 h，充分沉淀DNA。 13 000 r/min，4 ℃ 离心15 min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50 μl TE（pH8.0）溶解DNA。 把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/μl，储存于-20 ℃备用。 注意： I 1 g试样（如棉花种子）提取的DNA量应不小于200 μg。 II DNA的OD260/OD280的比值应在1.8左右，且OD260的值应在曲线的最高峰。 7.4 PCR反应 7..1 试样的PCR反应 PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再加约50 μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。 离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（Sad1基因、nos终止子、CaMV35S启动子：94℃,30 s56℃,30 s；72℃,30s；cry1Accry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因：94℃,1 min56℃, 1 min；72℃, 1 min ）；然后72℃恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4℃下保存。1 PCR反应体系 终浓度 单样品体积 ddH2O 31.25 10×PCR 缓冲液 1× 5 μl 25 mM MgCl2 2.5 mM 5 μl 10 mM dNTPs 0.2 mM 1 μl 10 μM Primer 1 0.5 μM 2.5 μl 10 μM Primer 2 0.5 μM 2.5 μl 5 U/μl Taq 酶 0.025 U/μl 0.25 μl 100 ng/μl DNA 模板 5 ng/μl 2.5 μl 总体积 50 μl 7.4.2 对照的PCR反应 PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。 DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照是指用转基因棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；空白对照是指