腺病毒載体操作手册1407-R2.docVIP

腺病毒载体操作手册 一、实验流程 制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。 二、实验材料 （一）腺病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP和 pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。 1、载体信息 腺病毒克隆载体图谱如下： 各载体用途如下表： 腺病毒载体名称 干扰 pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP 过表达 pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP