基因诊断与测序技术在其中的应用_陈然_2015-03-20.pptx

基因诊断与测序技术在其中的应用武汉分子生物学实验室 陈然2015-03-20内容内容-1基因诊断的概念基因诊断的概念基因预测又称基因体检，通过检测基因判断未来患某种疾病的可能性（风险预测），进而加强健康管理。基因检测基因诊断即分子诊断，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化等而做出的或辅助临床诊断的技术。基因诊断≠基因预测基因诊断≠基因治疗分子实验室开展的诊断类检测-1正常人不会发生融合基因或基因突变。某些疾病的患者会检测出融合基因或基因突变。分子实验室开展的诊断类检测-2正常人和某些疾病的患者间基因表达量不同。正常人之间的基因分型不同。内容-2基因测序技术及发展沿革基因测序技术DNA测序技术，即基因测序技术，是指测定DNA碱基序列的技术。人类基因组约有30亿个碱基对。大部分DNA测序的目的是得到特定基因的特定区域上序列信息——A、T、G、C四种碱基的排列顺序，即靶向基因测序/目标区域测序。通过对比被检者的碱基排列顺序是否与正常人一致，以此作为疾病诊断的依据。测序技术已广泛应用在医学、生物学研究，各类疾病的检测和筛查，物种鉴定，农作物筛选，基因工程……为什么使用测序技术进行诊断能够检测一段区域内的所有点突变。——具备成本和可操作性上的优势。二代测序技术的发展使得基因诊断的深度和广度得到极大扩展，使得多基因参与的复杂疾病检测，及高灵敏度检测成为可能。既能检测已知突变、也能检测未知突变。测序技术的发展Thermo Life/ABI3500xLRoche/454Genome Sequenser FLXThermo Life/ABISolid 5500PacBio RS SystemBeckman CoulterGenomeLab GeXPLife/Ion TorrentPGMIllunima HiSeq 2500一代测序二代测序三代测序1977起2005起2011起三代测序技术的比较一代测序二代测序(NGS)三代测序(3GS)技术原理双脱氧末端终止法（Sanger法）+毛细管电泳（CE）；Roche 454：高通量焦磷酸测序；Illumina：桥接PCR+边合成边测序；ABI Solid：寡聚物连接检测测序；Ion Torrent：H+电位信号检测+半导体芯片；——大规模平行测序（massively parallel DNA sequencing），生物信息技术处理产出数据；单分子实时测序；特点高读长；检测通量中等；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序；检测通量高；检测灵敏度高；开机运行成本高，但平摊到每样本、每碱基的成本低；适用于多基因，多位点的测序；可自动完成数据分析；高读长，特别适合于de novo测序；检测通量高；准确性低（81-83%）；开机运行成本很高；应用范围研究和临床检测；研究和临床检测；目前只用于研究；内容-3一代测序及片段分析检测流程一代测序检测流程标本收取处理物流医院前处理录入Lis系统分子实验室分拣、登记DNA标本（血液）提取核酸过程RNAPCR扩展目的基因片段PCR：Polymerase Chain Reaction（聚合酶链式反应）的简称。PCR是一个在体外特异性的复制一段DNA片段的过程。1985年由美国科学家Mullis发明。分子生物学最常用的体外扩增DNA的方法，使人们很快的获得大量拷贝的特异DNA片段，利于继续进行后续检测的分析。DNA模板；4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP ）；耐热性聚合酶(如Taq)；一对特异性引物；适量的反应缓冲液；基因扩增仪（PCR仪）312变性延伸退火温度时间PCR程序1个PCR循环包括变性、退火、延伸3步重复1~3步30-35轮DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增百万至亿倍以上，能够被电泳等后续方法检测到。子链延伸DNA加倍DNA单链与引物复性95℃模板DNA56℃DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点Taq引物1dATPdGTPdTTPdCTP引物2Taq95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮循环结束第2轮循环开始95℃PCR的基本原理72℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点Taq56℃TaqdATPdGTPdTTPTaqdCTPTaq72℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮循环结束第3轮、第4轮……经多次循环后靶片段扩增的数量No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824酶解消化SAP：Shr